Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

O objetivo geral deste experimento é relatar e comparar os dois ensaios usados para estudar a invasão e migração celular, o ensaio de câmara de Boyden e um ensaio otimizado de microscopia de vídeo in vitro baseado em microscópico. Esses experimentos podem ajudar a responder a questões-chave no campo de estudo de invasão e migração, como a escolha do método mais relevante. A principal vantagem deste ensaio otimizado de microscopia de vídeo in vitro baseado em arranhões é que ele fornece uma comparação reprodutível e precisa entre as condições de tratamento.

Embora esse método possa avaliar a migração e invasão celular, ele também pode ser aplicado a outros campos de estudo, como cicatrização ou regeneração de tecidos. Prepare as células SQ20B 72 horas antes do primeiro dia do ensaio, semeando duas vezes 10 elevado a 1/6 de células em 25 mililitros de meio de cultura em um frasco de 175 centímetros quadrados. Permita que as células cresçam até 80% de confluência celular a 37 graus Celsius.

No primeiro dia após a tripsinização e a contagem de células, semeie as células em um frasco de 25 centímetros quadrados com uma densidade celular de seis vezes 10 elevado a 1/5 de células em três mililitros de meio de cultura para cada condição a ser avaliada. Incube as células a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, deixe as células morrerem de fome, substituindo o meio em cada frasco por três mililitros de meio de soro bovino fetal baixo.

Deixe as células morrerem de fome na incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas. Para o ensaio de invasão, prepare as câmaras de Boyden revestidas 12 horas após o início da fome celular. Coloque cada câmara de Boyden na placa complementar.

Adicione 500 microlitros de meio celular de fome a cada câmara revestida. No dia seguinte, terceiro dia, use a placa complementar para preparar o quimioatraente. Encha cada poço da placa complementar de 24 poços com 750 microlitros de meio completo com 10% de FBS, hidrocortisona, penicilina e estreptomicina.

Transfira a câmara superior para a placa complementar pré-preenchida, tomando cuidado para evitar bolhas. Para o ensaio de invasão, remova cuidadosamente 450 microlitros de meio de cultura de cada câmara de Boyden. Após a tripsinização e contagem das células SQ20B famintas, semear três vezes 10 elevado a 1/4 de células em 500 microlitros de meio 0,1% BSA, dando uma diluição final de seis vezes 10 elevado a 1/4 de células por mililitro.

Coloque a câmara de Boyden na incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas. No quarto dia, remova cada inserção da placa complementar e remova cuidadosamente as células da câmara superior usando um cotonete. Em seguida, fixe e tinga cada inserto individualmente para obter a coloração May-Grunwald Giemsa usando um kit de coloração de acordo com as instruções do fabricante.

Realize análises microscópicas no quinto dia. Insira a placa complementar com as inserções em um microscópio de contraste de fase 20X e conte cada célula migrada na parte inferior da membrana. 72 horas antes do primeiro dia do ensaio, semeie duas vezes 10 para as células 1/6 SQ20B em 25 mililitros de meio de cultura em um frasco de 175 centímetros quadrados e permita que as células cresçam até 80% de confluência celular.

No primeiro dia após a tripsinização e a contagem de células, gere uma amostra pré-diluída das células SQ20B a uma densidade de quatro vezes 10 elevado a 1/5 de células por mililitro. Dispense 100 microlitros da solução celular em cada poço de uma placa de 96 poços para dar uma densidade final de quatro vezes 10 a 1/4 de células por 100 microlitros em cada poço. Coloque a placa na incubadora de 37 graus Celsius e deixe as células aderirem à placa por 12 a 16 horas.

No dia seguinte, leve a placa ao capô para ferir usando um dispositivo comercial de ferimento. Remova a parte superior da máquina de enrolar e coloque-a na solução do recipiente de lavagem. Insira a placa no suporte da placa de base e remova a tampa da placa.

Substitua o bloco de pinos guiando as buchas traseiras do bloco de pinos nos orifícios traseiros da placa de base. Empurre e segure a alavanca preta e levante o bloco de pinos enquanto continua segurando a alavanca preta para baixo. Usando uma pipeta com ponta cônica adaptada, remova imediatamente o meio de cada poço, tomando cuidado para não tocar na ferida.

Lave as células adicionando a cada poço 100 microlitros de meio celular aquecido a 37 graus Celsius. Após a segunda lavagem, use uma pipeta com ponta cônica adaptada para aspirar o meio celular. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio específico para cada condição de tratamento a cada poço, certificando-se de evitar a criação de bolhas nos poços.

Coloque a placa de 96 poços no rack adaptado do microscópio de vídeo. Usando o software de microscópio de vídeo, programe o cronograma de varreduras em uma imagem por poço. Para um experimento de invasão de migração, é necessário um intervalo máximo de duas horas.

Se o objetivo do experimento for produzir um vídeo, é preferível um intervalo máximo de 30 minutos. Monitore e verifique a migração celular por um período mínimo de 24 horas e até cinco dias usando uma máscara celular apropriada adaptada para cada tipo de célula para analisar a migração celular. Para obter uma máscara celular adaptada para cada linhagem celular, gere uma definição de processamento celular a partir do software usando uma coleção de imagens de células específica.

Trace as curvas e exporte os dados para uma planilha que pode ser usada para analisar e comparar os resultados. Para se preparar para o ensaio de invasão celular, semeie as células SQ20B da mesma forma demonstrada para o ensaio de migração celular e incube a placa de 96 poços na incubadora. No segundo dia do ensaio, prepare a matriz extracelular.

Descongele a matriz a quatro graus Celsius por pelo menos 12 horas antes de usar e certifique-se de que nenhum agregado esteja visível. Refrigere os tubos da microcentrífuga no gelo por cinco minutos. Diluir a matriz com pontas cônicas pré-resfriadas a quatro graus Celsius nos tubos de microcentrífuga pré-resfriados com meio celular resfriado a quatro graus Celsius para obter uma concentração final de 300 microgramas por mililitro.

Mantenha os tubos de microcentrífuga com matriz pré-diluída na geladeira a quatro graus Celsius. Recupere a placa de 96 poços da incubadora. Sob o capô, faça a ferida usando o dispositivo comercial de ferimento de acordo com o protocolo do fabricante, conforme demonstrado anteriormente.

Use uma pipeta com uma ponta cônica adaptada para remover imediatamente o meio de cada poço e tome cuidado para não tocar na ferida. Lave as células duas vezes usando 100 microlitros de meio celular aquecido a 37 graus Celsius. Após a segunda lavagem, coloque o prato no gelo por cinco minutos para equilibrar sua temperatura.

Remova o meio frio de cada poço, tomando cuidado para pipetar cuidadosamente a partir da borda e evitar tocar na ferida. Usando pontas cônicas pré-resfriadas a quatro graus Celsius, adicione 50 microlitros de matriz pré-diluída a cada poço. Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após 30 minutos, adicione 100 microlitros do meio celular adaptado a cada poço, conforme indicado para cada condição de tratamento. Coloque a placa no rack adaptado no microscópio de vídeo. Posteriormente, programe as varreduras e realize a análise de microscopia de vídeo, conforme demonstrado para o ensaio de migração celular.

Resultados representativos de uma membrana de Boyden após a fixação celular são mostrados. A membrana subótima tem aglomerados de células na parte superior da membrana e resultados não interpretáveis. Em contraste, a membrana ideal tem células contáveis na parte inferior da membrana coradas em azul.

Um resultado ideal do ensaio de ferida por arranhão é ilustrado por essas imagens de cicatrização de feridas em zero hora, 15 horas e 30 horas. Os critérios para um experimento de qualidade são uma ferida linear, nenhum fragmento de célula observado na ferida e confluência celular ideal. 90% de confluência é a densidade celular ideal para o ensaio de cicatrização de feridas, conforme mostrado no painel A. O painel C mostra um exemplo de baixa densidade celular e o painel B mostra aglomerados de células causados pela lavagem insuficiente do pellet celular.

Esta representação gráfica da cicatrização de feridas obtida usando o software de videomicroscópio mostra a quantificação dos parâmetros de confluência de células da ferida de acordo com o tempo para quatro condições de tratamento. Observou-se que o tratamento combinado diminui significativamente a migração celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar o processo de migração e invasão celular.