Um ensaio simples e de baixo custo para medir a deambulação em modelos de Mouse de Distrofia Muscular
29 de dezembro de 2017
Este protocolo descreve um sistema flexível e de baixo custo para medir a deambulação do mouse em um ensaio de atividade de campo aberto. Mostramos que um ensaio de 6 minutos de deambulação com base neste sistema detecta uma diminuição no movimento voluntário em camundongos mdx e distingue com precisão a melhoria em um músculo específico resgate destes animais.
O objetivo geral deste ensaio é medir a locomoção voluntária em modelos murinos de distrofia muscular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da distrofia muscular sobre a progressão da fraqueza muscular em modelos murinos de distrofia muscular e a eficácia de potenciais terapêuticas. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma medição não invasiva e reprodutível da atividade animal que pode ser facilmente adaptada a diversas configurações de pesquisa.
Em uma sala silenciosa com temperatura controlada e em um horário consistente do dia, posicione uma câmera sobre uma malha de arame acima da câmara de atividade para permitir a gravação em toda a arena e limpe a câmara com desinfetante. Imediatamente antes da gravação da atividade, permita que o camundongo segure a barra do dinamômetro digital e puxe suavemente para trás até que a barra seja solta. Registre a tensão máxima em newtons para cada ensaio.
Com um minuto de descanso entre as tentativas. Imediatamente após o ensaio de força de preensão, coloque o camundongo na câmara e inicie a gravação de vídeo, permitindo que o animal explore livremente. Após seis minutos, interrompa a gravação e devolva o camundongo à sua gaiola de origem.
Para a análise de rastreamento dos dados de vídeo, abra primeiro a gravação no software de edição de vídeo apropriado e defina a velocidade em duas vezes. Exporte o vídeo reduzido no formato de arquivo mp4 para análise de rastreamento e abra o vídeo no programa apropriado de análise de vídeo. Para definir a calibração da gravação de vídeo, utilize a ferramenta de linha para desenhar uma linha ao longo de um lado da câmara.
Clique com o botão direito na linha, selecione calibrar medida e insira o tamanho real do lado da câmara em centímetros. Para iniciar o rastreamento semi-automatizado da posição do camundongo, clique no cursor de movimento. Começando no quadro inicial do vídeo, clique com o botão direito no ponto a ser rastreado.
O ponto de rastreamento será marcado com um círculo azul. Use a seta para a direita no teclado para avançar o quadro. O ponto de rastreamento deve se mover automaticamente com base na posição da base da cauda.
Se a posição de rastreamento não estiver alinhada com o ponto de interesse em um determinado quadro, alinhe manualmente o círculo azul à posição de rastreamento. Quando todo o vídeo tiver sido rastreado, salve o vídeo e a sobreposição do traçado e selecione exportar para planilha para exportar os dados posicionais do traçado. De acordo com os resultados relatados em ensaios semelhantes, camundongos mdx nulos para distrofina submetidos a um protocolo de exercício imediatamente antes do teste demonstram movimento voluntário significativamente menor em um teste de campo aberto de seis minutos, em comparação com animais selvagens.
De fato, após o esforço leve de um desafio de força de preensão, os camundongos mdx normalmente permaneceram imóveis nos primeiros minutos do protocolo de deambulação, com um aumento moderado na movimentação entre os minutos quatro e cinco. Ao comparar animais selvagens e mdx sem um desafio de exercício, no entanto, nenhuma diferença na distância percorrida é detectada. Camundongos mdx transgênicos para expressão de utrofina são indistinguíveis dos animais selvagens, sem diferenças significativas na distância total percorrida ou em qualquer dos pontos de tempo cumulativos observados.
Para determinar o efeito da redução da taxa de amostragem, mediu-se a distância total percorrida em um minuto de vídeo com taxa de quadros completa e comparou-se com as distâncias obtidas a partir de versões subamostradas do conjunto de dados. Reduzir pela metade a taxa de quadros diminuiu a distância medida em 5% da distância original calculada. A precisão da distância medida reduz-se acentuadamente após esse ponto, embora conjuntos de dados altamente decimados ainda aproxinem de perto o trajeto do animal, destacando a importância de considerar a taxa de quadros e o processamento de sinal na avaliação da atividade animal, e demonstrando que uma alta resolução espacial pode ser mantida em dados de vídeo subamostrados.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar e analisar a ambulação de camundongos em um ambiente de campo aberto. Uma vez dominada, esta análise pode ser concluída em 15 a 30 minutos, se realizada corretamente. Este ensaio de baixo custo e não invasivo permite aos pesquisadores examinar a atividade motora em modelos murinos de distrofia muscular e pode servir como um primeiro passo informativo para medidas funcionais adicionais.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um sistema flexível e de baixo custo para medir a deambulação de camundongos em um ensaio de atividade em campo aberto. O método fornece uma medição não invasiva e reprodutível da atividade animal, que pode ser adaptada a diversas configurações de pesquisa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre Distrofia Muscular
- Análise Comportamental
Antecedentes
- O ensaio mede a ambulação voluntária em modelos murinos de distrofia muscular.
- Aborda questões fundamentais sobre a progressão da fraqueza muscular.
- A técnica foi desenvolvida para avaliar a eficácia de terapêuticas potenciais.
- O registro é feito em um ambiente controlado para garantir consistência.
Objetivo do Estudo
- Para medir o movimento voluntário em camundongos mdx.
- Para avaliar o impacto de intervenções específicas para o músculo.
- Para fornecer informações sobre a progressão da distrofia muscular.
Métodos Utilizados
- Uso de uma câmera posicionada acima da câmara de atividade para gravação.
- Limpeza da câmara com desinfetante antes dos ensaios.
- Permitir que o camundongo segure uma barra vertical para medir a tensão máxima.
- Registro da atividade durante um ensaio de ambulação de 6 minutos.
Resultados Principais
- O sistema detecta diminuições no movimento voluntário em camundongos mdx.
- Ele distingue com precisão melhorias decorrentes de resgate específico do músculo.
- Os resultados são reprodutíveis em diferentes ensaios.
- O método é adaptável a diversos ambientes de pesquisa.
Conclusões
- Este ensaio é eficaz para estudar a distrofia muscular em camundongos.
- Ele fornece dados valiosos sobre a eficácia de tratamentos potenciais.
- A abordagem é flexível e pode ser utilizada em diversos ambientes de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição da locomoção voluntária em modelos murinos fornece uma leitura translacional da função motora na distrofia muscular, diretamente análoga a pontos finais clínicos como o teste de caminhada de 6 minutos. Este ensaio baseado em vídeo, de baixo custo, permite a avaliação reprodutível e não invasiva da progressão da doença e da resposta terapêutica em estudos pré-clínicos. Ao detectar déficits de atividade em camundongos mdx sem distrofina e sua recuperação mediante a expressão de utrofina, o método apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos para doenças neuromusculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da locomoção voluntária como parâmetro funcional da força muscular em modelos distróficos.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos por meio da correlação reprodutível entre genótipo e fenótipo em camundongos mdx comparados aos grupos selvagens e recuperados.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir intervenções eficazes (por exemplo, transgene da utrofina) que normalizam os níveis de atividade até os valores observados em tipo selvagem.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, utilizando métricas padronizadas de locomoção em campo aberto.
- Reprodutibilidade: Fornece saídas quantitativas baseadas em distância e tempo, passíveis de padronização do ensaio entre diferentes laboratórios.
- Escalabilidade: Aproveita software gratuito e de código aberto, juntamente com hardware acessível, permitindo a reutilização da plataforma em diversos ambientes de pesquisa sem necessidade de equipamentos especializados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela déficits de deambulação relevantes para o paciente, proporcionando continuidade translacional desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se os efeitos observados decorrem de resgate específico no músculo ou de alterações inespecíficas na atividade.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de prosseguir/interromper ao correlacionar a recuperação da deambulação com o engajamento do alvo e a modulação da via.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores, oferecendo uma conexão funcional entre mecanismos moleculares e resultados fenotípicos em modelos de distrofia muscular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar intervenções genéticas ou farmacológicas a alterações mensuráveis no movimento voluntário.
- Triagem: Permite a preparação para ensaios por meio de rastreamento reprodutível baseado em vídeo, gerando desfechos quantificáveis de deambulação para avaliação de compostos.
- Análise: Gera fluxos de dados posicionais e temporais que permitem às equipes comparar a atividade locomotora entre genótipos, tratamentos e pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao reproduzir avaliações clínicas de deambulação, facilitando o alinhamento de biomarcadores e a modelagem preditiva.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável e de baixo custo para testes de deambulação, reduzindo a dependência de instalações centrais especializadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em ensaios de função motora.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio do rastreamento de código aberto e condições ambientais controladas.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao eliminar a necessidade de sistemas caros de rastreamento de movimento, mantendo a qualidade dos dados.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base no resgate funcional de fenótipos de locomoção em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento básico em gravação de vídeo e software de rastreamento de código aberto (por exemplo, alinhamento manual quadro a quadro).
- Depende de equipamentos de imagem padrão e controles ambientais consistentes (iluminação, temperatura, horário do dia).
- Necessita adesão ao protocolo por toda a equipe para garantir reprodutibilidade entre diferentes locais e operadores.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tamanhos de câmara, linhagens de camundongos e níveis de atividade.
- Envolve compromissos entre taxa de quadros e precisão da medição, já que a redução da taxa diminui a precisão no cálculo de distância.
