Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados
19 de março de 2018
Este protocolo descreve uma técnica melhorada para a coleção abundante de líquido cerebrospinal (CSF), sem contaminação de sangue. Com a maior coleção de amostra e pureza, mais análises podem ser executadas usando o CSF para aprofundar nossa compreensão das doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.
O objetivo geral deste procedimento é melhorar a coleta de líquido cefalorraquidiano de camundongos sem contaminação do sangue. Este método fornece uma maneira fácil e confiável de coletar LCR para monitorar os biomarcadores de doenças neurais. A principal vantagem dessa técnica é que a adição com o micromanipulador para auxiliar na coleta de LCR de camundongos diminui a contaminação do sangue durante a coleta.
Comece colocando um capilar de vidro puxado em um suporte capilar que está firmemente montado em um micromanipulador. Em seguida, durante a visualização através de um microscópio de dissecação, use uma pinça reta para quebrar a ponta do capilar afiado de modo que o diâmetro interno da ponta quebrada seja de cerca de 10 a 20 mícrons. Em seguida, conecte um tubo fino e uma seringa na outra extremidade do suporte capilar, conecte o tubo fino e a seringa com uma válvula de três vias e mude a válvula de três vias para abrir.
Em seguida, mergulhe a seringa para expelir quaisquer contaminantes e criar pressão positiva no tubo capilar. Repita isso algumas vezes desconectando e reconectando a seringa à válvula de três vias. Em seguida, aspire o ar para 100 a 200 microlitros antes da reconexão final da seringa com a válvula de três vias.
Mova o micromanipulador com o capilar de vidro para o lado para evitar danos durante o procedimento cirúrgico. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de que o camundongo foi totalmente anestesiado, beliscando os quatro membros e observando a ausência de reação. Em seguida, use uma tesoura de dissecação para cortar e aparar o cabelo na parte de trás da cabeça do rato, de cima dos olhos entre as orelhas até a parte inferior do pescoço.
Prenda a cabeça do mouse usando um adaptador de mouse de quadro estereotáxico. Certifique-se de que a cabeça não possa se mover e esteja firmemente presa no adaptador, empurrando suavemente para baixo a cabeça do mouse. Use uma tesoura e uma pinça curva para cortar a pele do rato na parte de trás do pescoço e, em seguida, no meio do crânio entre as orelhas e os olhos do rato.
Separe a pele e o tecido e saia da área sobre a cisterna magna. Enquanto visualiza através do microscópio de dissecação, disseque cuidadosamente as últimas camadas finas de músculo sobre a base do crânio usando uma pinça e mova essas camadas de músculo para o lado e para fora da área de interesse. Assim que a dura-máter sobre a cisterna magna estiver exposta, use um cotonete úmido para limpar a membrana e, em seguida, use um cotonete seco para secar a área.
A cisterna magna parece triangular com um a dois grandes vasos sanguíneos correndo pela área. Ambos os lados ou entre os vasos sanguíneos são ideais para inserção capilar e coleta de LCR. Uma vez que a cisterna magna esteja exposta, use o micromanipulador para alinhar o capilar de vidro com a parte de trás da cabeça do mouse, de modo que a ponta afiada fique logo atrás da membrana em um ângulo de 30 a 45 graus.
Em seguida, mergulhe a seringa uma ou algumas vezes e, em seguida, mova o êmbolo para trás 100 a 200 microlitros para garantir que não haja contaminantes e que haja pressão negativa no capilar de vidro. Em seguida, aproxime a ponta capilar da membrana até que a resistência possa ser vista, mas sem perfurar a membrana. Bata nos controles do micromanipulador para bater suavemente no tubo capilar através da membrana.
O LCR deve ser puxado automaticamente para dentro do tubo capilar assim que a abertura for perfurada. Deixe o capilar no lugar para coletar lentamente o LCR. Se o LCR parou de fluir, puxe lentamente a seringa aproximadamente 50 microlitros para criar mais pressão negativa no capilar.
Dez a 15 microlitros de LCR são coletados em 10 a 30 minutos. Uma vez coletado o volume desejado de LCR, feche a tubulação deslocando a válvula de três vias para fechar e remova a seringa conectada à tubulação. Abra e feche a tubulação para criar pressão equalizada no capilar, na tubulação e na área externa ao capilar.
Em seguida, reconecte a seringa antes de remover suavemente o capilar de vidro do mouse usando o micromanipulador. Em seguida, coloque o tubo de coleta contendo um microlitro de inibidor de protease 20X sob a ponta afiada do capilar de vidro. Abra o tubo e mergulhe suavemente a seringa.
O LCR deve fluir para fora do capilar e para o tubo de coleta. Após a coleta, centrifugue o LCR por pulso para misturar a amostra com o inibidor de protease no fundo do tubo de coleta. As amostras de LCR podem ser aliquotadas e armazenadas para análise posterior a 80 graus Celsius negativos.
O LCR coletado de camundongos APP / PS1 demonstrou um aumento significativo nos níveis de A beta 42 humano aos 12 meses de idade. Em camundongos do tipo selvagem, nenhum A beta 42 humano foi detectado. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em uma hora se executado corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar vasos sanguíneos ao inserir o capilar e fazer apenas pequenos ajustes com o micromanipulador durante a coleta do LCR para evitar contaminação com sangue.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método aprimorado para coletar líquido cefalorraquidiano (CSF) de camundongos com contaminação sanguínea mínima. Utilizando um micromanipulador, esta técnica aumenta a pureza e o volume da amostra, permitindo uma melhor análise de biomarcadores em doenças neurológicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise do líquido cefalorraquidiano
- Pesquisa em doenças neurológicas
Contexto
- O LCR é essencial para compreender doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.
- A contaminação por sangue durante a coleta pode comprometer os resultados da pesquisa.
- Métodos aprimorados de coleta podem aumentar a integridade da amostra para análise de biomarcadores.
- Essa técnica tem como objetivo facilitar o estudo de condições neurodegenerativas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a coleta de LCR de camundongos.
- Minimizar a contaminação sanguínea durante o processo de coleta.
- Permitir um monitoramento mais preciso de biomarcadores de doenças neurológicas.
Métodos Utilizados
- O método utiliza um micromanipulador com uma capilar de vidro para a coleta precisa de LCR da cisterna magna.
- Os camundongos são adequadamente anestesiados, e técnicas cirúrgicas são empregadas para expor a cisterna magna para a inserção da capilar.
- Nenhum fluxo de trabalho de multiômica é referenciado; o foco está na coleta de LCR.
- O procedimento pode ser concluído em aproximadamente uma hora com prática.
- O LCR é misturado com um inibidor de protease após a coleta para preservação.
Resultados Principais
- A técnica permite a coleta de 10 a 15 microlitros de LCR em 10 a 30 minutos.
- O LCR coletado de camundongos APP/PS1 mostrou um aumento significativo nos níveis de A beta 42 humano aos 12 meses.
- Não foi detectado A beta 42 nas amostras de camundongos selvagens.
- A eficiência do procedimento e sua capacidade de evitar contaminação sanguínea foram demonstradas com sucesso.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método eficaz para obter LCR de camundongos, minimizando a contaminação.
- A maior pureza e volume do LCR coletado podem aprimorar a análise de biomarcadores na pesquisa de doenças neurais.
- Contribui para uma melhor compreensão da dinâmica do líquido cefalorraquidiano em distúrbios neurológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coleta confiável de líquido cefalorraquidiano (LCR) é essencial para a descoberta de biomarcadores na pesquisa de doenças neurodegenerativas, em que a pureza da amostra impacta diretamente a qualidade dos dados e a confiança na validação de alvos. Este método aborda um gargalo crítico nos fluxos de trabalho de neurociência murina, permitindo a extração de LCR com maior rendimento e baixa contaminação, apoiando uma desmistificação mecanicista mais robusta de hipóteses terapêuticas. O acesso melhorado ao LCR potencializa a continuidade translacional desde a identificação de alvos até o monitoramento pré-clínico de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da análise de biomarcadores em um sistema relevante para a doença, com menor ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Oferece acesso reprodutível ao LCR para monitoramento longitudinal do engajamento do alvo e modulação da via.
- Valor Preditivo: Apoia decisões de avançar/interromper baseadas em biomarcadores, aumentando a confiança nas alterações moleculares relacionadas ao alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece amostras de LCR purificadas adequadas para ensaios quantitativos de biomarcadores, aumentando a confiabilidade do rastreamento.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo das amostras, reduzindo a variabilidade em fluxos de trabalho analíticos subsequentes.
- Escalabilidade: Permite a coleta consistente de LCR em diferentes coortes, apoiando a validação e reprodutibilidade dos ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores desde a descoberta até a validação pré-clínica, utilizando modelos relevantes para a doença.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite o monitoramento de biomarcadores-alvo, como o A beta 42 humano em camundongos APP/PS1, fortalecendo a confiança preditiva.
- Avanço com Base em Risco Ajustado: Permite decisões de progressão baseadas em dados, com base em alterações detectáveis de biomarcadores em modelos de doenças neurológicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer uma fonte confiável de amostras preliminares para análise de biomarcadores, conectando as fases de validação de alvo e otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da medição de biomarcadores no LCR.
- Triagem: Permite a geração de amostras prontas para ensaio com volume e pureza consistentes para avaliação de compostos.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de biomarcadores (por exemplo, beta amiloide humano 42) que facilitam a análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a dinâmica de biomarcadores no LCR com a progressão pré-clínica da doença em modelos genéticos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade padronizada e reutilizável para coleta de LCR em programas de descoberta em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio de dados de biomarcadores mais limpos e de maior volume.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização da coleta de LCR entre laboratórios e estudos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir experimentos fracassados devido a amostras contaminadas ou insuficientes.
- Impacto sobre a Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em flutuações confiáveis de biomarcadores em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia e operação de micromanipuladores para posicionamento preciso da cápsula capilar.
- Depende de microscopia de dissecação, estrutura estereotáxica e instrumentação para manipulação de fluidos.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos cirúrgicos e de coleta para garantir a reprodutibilidade.
- A adaptação a outros modelos pode exigir ajustes anatômicos devido a variações na acessibilidade da cisterna magna.
- As limitações práticas incluem a dependência da habilidade do operador e a variabilidade fisiológica potencial no rendimento de LCR.
