Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

O objetivo geral da funcionalização química da superfície de nanopartículas de HEV é fornecer uma abordagem repetível e consistente para a conjugação de moléculas imunogênicas, terapêuticas e diagnósticas direcionadas à superfície de nanopartículas de HEV para fins de diagnóstico e tratamento.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da nanomedicina, como como monitorar o direcionamento aprimorado ao câncer e a distribuição de nano terapêuticos. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente reprodutível, eficiente e muito mais fácil de realizar em comparação com a geração de engenharia genética.

As demonstrações dos procedimentos serão realizadas por Michelle Nguyen e Ivan Ruiz, assistentes de pesquisa do nosso laboratório.

Inicie este protocolo com a produção e purificação de nanopartículas do vírus da hepatite E conforme descrito no protocolo textual.

Dilua as amostras de nanopartículas de HEV para concentrações entre 0,5 e dois miligramas por mililitro com MES 10 milimolar, pH 6,2, para a obtenção de imagens em MET. Iônize as grades revestidas com carbono com descarga de corona de 40 miliampères por 30 segundos para produzir uma superfície de carbono hidrofílica. A superfície de carbono hidrofílica das grades só permanece estável por 30 minutos após o tratamento com descarga de corona. Após a ionização, segure a grade com pinça e adicione dois microlitros da amostra de nanopartículas de HEV à grade.

Após 15 a 30 segundos, remova o excesso do grade com papel filtro. Em seguida, lave imediatamente a grade com água bidestilada e seque novamente com papel filtro. Adicione imediatamente dois microlitros de acetato de uranila a dois por cento à grade. Após 15 segundos, remova o excesso com papel filtro. Seque as grades da amostra colocando-as em um armário eletrônico desumidificador durante a noite.

Dependendo da amostra, a microscopia eletrônica criogênica ou criomicroscopia eletrônica pode ser necessária para a visualização e caracterização da estrutura. Transfira a grade para um MET e obtenha imagens com aumento de 10 a 80 mil vezes. As nanopartículas do vírus da hepatite E aparecem na MET como proteínas icosaédricas vazias com diâmetro aproximado de 27 nanômetros, devido à ausência de RNA viral.

Para realizar a conjugação em um único passo de nanopartículas de HEV e biotina ligada a maleimida, aplique primeiro as nanopartículas de HEV em unidades de diálise miniatura. Diализe as nanopartículas contra PBS 0,01 molar, pH 7,4, à temperatura ambiente por uma hora, conforme o protocolo do fabricante. Após a diálise, transfira as nanopartículas de HEV para tubos de 1,5 mililitro e meça a concentração proteica em 280 nanômetros utilizando um espectrofotômetro. Misture as nanopartículas a uma concentração de um miligrama por mililitro com uma quantidade igual de biotina-maleimida 100 micromolar e PBS 0,01 molar, pH 7,4, para obter uma proporção molar de um para cinco. Após reagir durante a noite a quatro graus Celsius, remova a biotina-maleimida não ligada utilizando um procedimento com coluna de dessalinização por centrifugação, conforme o protocolo do fabricante. Analise as amostras por meio de eletroforese SDS-PAGE padrão em condições redutoras.

Utilizando os procedimentos padrão, prepare um blot ocidental quimioluminescente usando estreptavidina ligada à HRP e capture o sinal quimioluminescente por meio de filme radiográfico.

Para realizar a conjugação em duas etapas do ligante específico para células de câncer de mama, LXY30, às cisteínas expostas na superfície de nanopartículas de HEV, primeiro aplique as nanopartículas em unidades de diálise miniatura e realize a diálise contra PBS 0,01 molar, pH 7,4, à temperatura ambiente durante uma hora. Em seguida, transfira as nanopartículas de HEV para tubos de 1,5 mililitro e meça a concentração proteica em 280 nanômetros utilizando um espectrofotômetro. A seguir, combine 650 micromolar de maleimida-azida e 650 micromolar de alquino-LXY30 com 200 micromolar de sulfato de cobre e um milimolar de ácido ascórbico. Isso forma o LXY30 ligado ao maleimida em 650 micromolar. Incube a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, misture as nanopartículas de HEV a um miligrama por mililitro com cerca de 10% em volume de LXY30 ligado ao maleimida, obtendo uma razão molar de um para três. Reaja durante a noite a quatro graus Celsius. Devido à concentração relativamente alta de LXY30 com maleimida, as concentrações finais dos reagentes, como o sulfato de cobre, são reduzidas cerca de dez vezes após a mistura. Para evitar danos às nanopartículas do vírus da hepatite E, outra opção é o método de conjugação livre de cobre.

Remova o LXY30 de clique maleimida não ligado utilizando uma coluna de dessalinização por centrifugação, conforme o protocolo do fabricante. Mantenha as nanopartículas de HEV ligadas ao LXY30 a quatro graus Celsius. Para realizar a conjugação em um único passo das nanopartículas de HEV com LXY30 e a marcação fluorescente Cy5.5, primeiro misture as nanopartículas ligadas ao LXY30 até uma concentração de um miligrama por mililitro com um volume igual da marcação fluorescente Cy5.5, obtendo uma razão molar de um para cinco. Após deixar a mistura reagir durante a noite a quatro graus Celsius, remova o NHS Cy5.5 não ligado utilizando o procedimento de coluna de dessalinização por centrifugação, conforme o protocolo do fabricante. Mantenha as nanopartículas de HEV ligadas ao LXY30 e Cy5.5 a quatro graus Celsius.

Duas abordagens foram tentadas para a funcionalização com LXY30 de nanopartículas de HEV com finalidade de direcionamento a células tumorais. Quando nanopartículas de HEV 573C foram ligadas primeiro ao azida de maleimida, seguido por uma reação de química click com alquino LXY30, as nanopartículas de HEV 573C pareceram se desmontar sob observação em microscopia eletrônica de transmissão (TEM). No entanto, uma reação inicial de química click entre alquino LXY30 e azida de maleimida para formar LXY30 ligado ao maleimida, seguida pela conjugação a nanopartículas de HEV modificadas, não afetou sua estrutura, e as nanopartículas de HEV 573C permaneceram intactas. Nanopartículas de HEV ligadas a LXY30 e Cy5.5 foram aplicadas a células de câncer de mama cultivadas e observadas por microscopia confocal. As imagens de fluorescência no infravermelho próximo obtidas por microscopia confocal indicam que as nanopartículas de HEV ligadas a LXY30-Cy5.5 apresentaram maior afinidade de ligação e maior internalização em células de câncer de mama MDA MB-231 em comparação com nanopartículas de HEV ligadas apenas ao Cy5.5.

As implicações desta técnica estendem-se ao exame de moléculas terapêuticas e de direcionamento multimodal que permitem o direcionamento preciso e o diagnóstico de tumores sem causar danos às células normais. Embora este método possa fornecer informações sobre o câncer e o direcionamento de tumores por meio da modularização química da superfície, ele pode ser aplicado ao diagnóstico precoce do câncer, triagem e tratamento guiado por imagem.