Método do impalement do microelétrodo para gravar o potencial da membrana de uma artéria cerebral média Cannulated

Este protocolo pode ser usado para medir o potencial de membrana dos vasos sanguíneos normais e doentes e para avaliar agentes farmacológicos que modulam o potencial da membrana, o tom vascular e o fluxo sanguíneo. Os potenciais de membrana gerados a partir desta técnica estão próximos da faixa fisiológica, uma vez que os músculos vasculares lisos dentro de um vaso estão em sincronia. Antes de iniciar o procedimento, coloque um amplificador de eletrometro diferencial de canal duplo perto da câmara do vaso no local desejado.

Use um cabo BNC-BNC para conectar a saída do amplificador canal A ou B à entrada do canal do digitalizador. Monte a sonda no micromanipulador, e gire o micromanipulador em direção ao microscópio e ao miógrafo em uma mesa livre de vibrações. Coloque os botões e os interruptores na parte frontal do amplificador nas posições apropriadas para o experimento, conforme descrito no manual.

Em seguida, conecte o solo do banho ao solo do circuito do amplificador com um eletrodo apropriado, e certifique-se de que a gaiola esteja aterrada ao chassi do amplificador. Para preparar os microeletrodes de vidro borossilicato, use um puxador padrão para alcançar um taper curto, gradual, de oito a dez milímetros com um diâmetro de menos de um micrômetro, looping duas vezes para maiores resistências e pontas menores. Use uma seringa de microfibra para encher o microeletrodo com cloreto de potássio de três molares, retraindo lentamente o êmbolo durante a injeção para permitir o espaço para o fluido encher e evitar a formação de bolhas dentro do microeletrodo.

Coloque o microelerode totalmente carregado sobre o suporte de microeletroder, e empurre cuidadosamente a haste do eletrodo para dentro do suporte através do orifício entediado. Remova qualquer excesso de fluido com um tecido de laboratório e conecte o conjunto do suporte de eletrodo à sonda do amplificador. Realize um teste de eletrodo para medir a resistência ao eletrodo.

Em seguida, abra o software de gravação, atribua um nome ao arquivo e salve o arquivo para análise futura. Em seguida, enxágue a câmara de miógrafo com água destilada várias vezes antes de carregar a câmara com cinco mililitros de solução de sal fisiológico normal, ou PSS. Usando uma seringa de cinco ou dez mililitros, encha ambas as cânulas de vidro e a tubulação anexada com PSS normal filtrado sem introduzir bolhas de ar, e use fórceps contundentes para fazer um meio nó em duas suturas de nylon monofilamento 10-0.

Em seguida, usando fórceps de dissecção sob um microscópio de dissecção, coloque os nós de sutura parcialmente fechados em ambas as cânulas ligeiramente longe das pontas. Para o isolamento da artéria cerebral média, use tesouras de mola e fórceps para identificar e dissecar um segmento não cerrado da artéria cerebral média, com um diâmetro interno de 100 a 200 micrômetros, do cérebro de rato. Use fórceps finos para montar a artéria cerebral média nas cânulas de vidro e aperte as suturas para fixar a artéria na cânula.

Feche a cânula distal para que não haja fluxo dentro da artéria, e conecte a pipeta de entrada a um reservatório de PSS. Visualize a artéria cerebral média canulada usando uma câmera de dispositivo acoplada por carga montada em um microscópio invertido e software de imagem. Defina o comprimento axial do MCA a um comprimento aproximado, de tal forma que não pareça nem rígido nem flácido.

Equilibre a solução de banho com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Mergulhe o solo do amplificador no PSS do miógrafo. Ilumine a câmara do vaso e visualize a ponta do microeletro na solução de banho através do microscópio.

Usando o micromanipulador, mova a ponta do microeletrodo perto da parede externa do vaso sanguíneo, e comece a gravação. Mova lentamente a ponta do microeletrodo em direção ao navio, visando o centro da embarcação. Quando a ponta chegar perto do vaso, avance o eletrodo para a frente em um movimento rápido para empalar a membrana do músculo.

Uma vez penetrada a membrana, podem ser observadas alterações no potencial da membrana. Não toque no micromanípulo uma vez que a membrana tenha sido empalada. Quando as possíveis alterações da membrana forem registradas, use o manipulador para remover o microeletrodo em um movimento rápido e pare a gravação antes de salvar os arquivos de dados.

O emalamento é considerado bem sucedido quando há uma rápida deflexão aos valores negativos, o potencial da membrana é estável por um mínimo de 30 segundos, e a tensão retorna abruptamente a zero milvolts após a remoção do eletrodo. Após uma possível estabilização de emalamento e membrana, drogas de interesse podem ser perfundidas no banho e mudanças no potencial da membrana podem ser registradas. Neste experimento representativo, a perfusão com cloreto de potássio despolarizou a membrana em aproximadamente seis milivolts, enquanto a perfusão com um ativador dependente de cálcio de grandes canais de potássio ativados por cálcio hiperpolarizou a membrana em quase quatro milivolts.

A coisa mais importante a se lembrar é puxar microeletros altamente resistentes que têm um curto e gradual taper com um diâmetro de menos de um micrômetro.