Avaliação da disponibilidade mineral em rações de peixe usando métodos complementares demonstrados com o exemplo de zinco no salmão atlântico
29 de outubro de 2021
Este artigo explica detalhadamente uma abordagem sistemática para avaliar a disponibilidade de micro minerais no salmão atlântico. A metodologia inclui ferramentas e modelos com crescente complexidade biológica: (1) análise de especiação química, (2) solubilidade in vitro, (3) estudos de absorção em linhas celulares e (4) estudos de peixe vivo.
Estudamos a disponibilidade de solubilidade de microducos como o selênio de zinco com diferentes formas químicas ou fontes, como chamamos, no contexto de mudança da composição alimentar. Em uma suíte de radionuclídeo, pese aproximadamente 0,2 gramas de amostras de ração de salmão do Atlântico moído, e misture-o com um radiotracer de zinco de atividade específica conhecida em um tubo de amostra de volume de cinco mililitros. Prepare seis outras alíquotas do tampão e adicione um dos aminoácidos mostrados aqui a cada um para alcançar uma concentração molar final de cinco milimiliar.
Adicione tampão luminal intestinal de água doce para alimentar a amostra. Em seguida, adicione o tampão luminal intestinal de água doce aos aliquots tampão contendo os aminoácidos. Feche os tubos e gire-os em um rotador rotativo a 25 RPM por 30 minutos.
Em seguida, centrífugas a 1.157 x g por 10 minutos, para separar as frações solúveis e não solúveis. Use um caixa gama para medir as contagens por minuto do radiotracer de zinco nas frações solúveis e não solúveis. Lave a linha de célula intestinal derivada da truta arco-íris duas vezes com um mililitro de solução EDTA, e sifão a solução após cada lavagem usando uma pipeta.
Trate as células lavadas com solução de trippsina de 0,25%. Gire suavemente o frasco em ângulos agudos por dois minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio L-15 contendo 5% de FBS para neutralizar a trippsina.
Usando uma pipeta estéril, decante a suspensão celular resultante em um tubo cônico de centrífuga inferior. Centrifugar a 130 x G por três minutos. Em seguida, usando um hemótmetro, determine a densidade das células colhidas por contagem manual.
Semear as células em 24 placas de poço a uma densidade celular de 50.000 células por mililitro, por poço, e incubar as placas a 19 graus Celsius sob uma atmosfera normal por 48 horas antes dos experimentos. Depois de alimentar o peixe por 11 dias e eutanásia-los, recolham uma amostra agrupada das fezes do peixe, retirando da barbatana ventral para o ânus e coloque-o em um prato. Use uma espátula para transferir as fezes da placa para um tubo cônico de 50 mililitros.
Armazene imediatamente as amostras a 20 graus Celsius. Neste estudo, a disponibilidade mineral da ração de peixe é avaliada por meio de uma série de métodos complementares. A análise representativa da ração de salmão atlântico através do método de espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado à cromatografia, fornece dados sobre as espécies químicas de zinco encontradas na fração solúvel.
Cinco picos contendo zinco podem ser vistos nesta fração, cada um com um peso molecular diferente. As espécies químicas de zinco encontradas na fração solúvel podem ter diferentes fontes, porque a ração utilizada contém ingredientes à base marinha e à base de plantas, e é suplementada. A faixa de peso molecular dessas espécies sugere que esses compostos podem ser metaloproteínas.
Enquanto a solubilidade do zinco suplementado 65 aumenta a presença de todos os aminoácidos testados, maior solubilidade é encontrada com histidina e lisina. A absorção de zinco apical em células Arteca GC é significativamente influenciada pela presença de L-Met ou DL-Met em duas concentrações milimiliar. Além disso, o impacto da methionina na captação de zinco é afetado negativamente pela presença de BCH.
A principal vantagem deste protocolo é que tentamos combinar diferentes abordagens em estudos visuais, analíticos e invivos, para comparar e elogiar uns aos outros quando se trata de estudar a disponibilidade mineral.
Visão Geral
Este artigo apresenta uma abordagem sistemática para avaliar a disponibilidade de zinco (Zn) em salmão-do-atlântico (Salmo salar) na alimentação. Ao integrar metodologias analíticas, in vitro e in vivo, o estudo investiga como diferentes espécies químicas de Zn na ração influenciam a solubilidade e a absorção de Zn. Os protocolos descritos fornecem uma estrutura abrangente para avaliar a biodisponibilidade de microminerais na dieta em pesquisas de nutrição em aquicultura.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Nutrição em aquicultura
- Análise de minerais-traço
- Fisiologia de peixes
Antecedentes
- A avaliação da disponibilidade dietética de micro-minerais é um desafio significativo na nutrição de peixes.
- As rações contêm várias espécies químicas de Zn, que podem afetar a biodisponibilidade desse elemento.
- Compreender os mecanismos de solubilidade e absorção de Zn é essencial para otimizar a saúde dos peixes e a formulação das rações.
- A combinação de múltiplas metodologias pode fornecer uma visão mais completa da disponibilidade de minerais.
Objetivo do Estudo
- Avaliar sistematicamente a disponibilidade de diferentes espécies químicas de Zn em rações para salmão do Atlântico.
- Comparar métodos in vitro e in vivo para avaliar a solubilidade e a absorção de Zn.
- Determinar a influência de ligantes de aminoácidos na biodisponibilidade de Zn.
Métodos Utilizados
- Extração e análise de espécies de Zn de ração utilizando cromatografia de exclusão por tamanho acoplada à espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (SEC-ICP-MS).
- Avaliação da solubilidade in vitro do Zn dietético utilizando técnicas com traçadores radioativos e suplementação com aminoácidos.
- Medição da captação de Zn em uma linhagem celular epitelial intestinal de truta-arco-íris (RTgutGC).
- Ensaio alimentar in vivo com salmão-do-atlântico, seguido pela coleta e análise de fezes para determinar a disponibilidade aparente de Zn.
Resultados Principais
- Várias espécies químicas de Zn com pesos moleculares variados foram identificadas na fração solúvel de rações.
- A solubilidade do Zn aumentou na presença de todos os aminoácidos testados, sendo os maiores efeitos observados com histidina e lisina.
- A captação de Zn em células RTgutGC foi significativamente influenciada pela metionina, e esse efeito foi modulado pela presença de BCH.
- Os achados in vitro não se correlacionaram totalmente com os resultados in vivo, destacando a complexidade da avaliação da biodisponibilidade de Zn.
Conclusões
- A ração contém diversas espécies de Zn, e a eficiência das fontes orgânicas de Zn depende do ligante específico de aminoácido utilizado na quelatação.
- Protocolos in vitro fornecem informações valiosas, mas nem sempre podem prever a disponibilidade mineral in vivo.
- Uma abordagem metodológica combinada aprimora a compreensão da biodisponibilidade de Zn em rações para peixes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação sistemática da biodisponibilidade de minerais em rações para aquicultura é fundamental para a confiança preditiva na otimização nutricional e na formulação de rações com ajuste de risco. A integração de métodos analíticos, in vitro e in vivo permite a redução mecanicista de riscos na entrega de micronutrientes e apoia a continuidade translacional desde a descoberta até o desenvolvimento prático de rações. Essa abordagem orienta decisões sobre a seleção de ingredientes e estratégias de suplementação para melhorar a saúde e o desempenho de crescimento dos peixes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de absorção de minerais e a clarificação das vias de absorção de micronutrientes.
- Apoia a redução de riscos biológicos ao distinguir o impacto de diferentes espécies químicas de zinco na biodisponibilidade.
- Facilita a previsão confiável na seleção de fontes eficazes de minerais para formulações de rações.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara sistemas analíticos e in vitro validados para avaliação quantitativa da solubilidade mineral e absorção.
- Padroniza protocolos para medição reprodutível de espécies de zinco e sua biodisponibilidade.
- Permite triagem confiável de ingredientes para rações e estratégias de quelatamento para suplementação mineral.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro e in vivo para avaliar a relevância translacional dos dados de biodisponibilidade mineral.
- Apoia a continuidade do descobrimento mecanicista até a validação pré-clínica na nutrição em aquicultura.
- Informa o avanço com ajuste de risco em formulações de rações com base em resultados comparativos de biodisponibilidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa abordagem multímétodo abrange desde a descoberta inicial até a avaliação pré-clínica na alimentação, integrando química analítica, ensaios baseados em células e validação in vivo para avaliação abrangente da biodisponibilidade mineral.
- Biologia da Descoberta: Esclarece a influência das espécies químicas de zinco e dos ligantes de aminoácidos sobre os mecanismos de absorção.
- Triagem: Fornece dados quantitativos de solubilidade e absorção para orientar a seleção de ingredientes e formulação.
- Análises: Oferece especiação de zinco resolvida por peso molecular e medidas de absorção baseadas em traçadores radiativos.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro com resultados in vivo para orientar decisões no desenvolvimento de rações.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma estrutura reutilizável para avaliação da biodisponibilidade de minerais em diferentes tipos de ração e espécies.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de nutrição mineral.
- Valor Operacional: Padroniza e amplia protocolos para avaliação reprodutível e comparável entre estudos da biodisponibilidade mineral.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir ou não prosseguir na seleção de ingredientes alimentares e suplementos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de formulações alimentares e estratégias de suplementação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento especializado em química analítica, cultivo celular e estudos in vivo em aquicultura.
- Requer acesso a instrumentação de SEC-ICP-MS e capacidade de manipulação de radio-traçadores.
- Exige padronização entre equipes para garantir comparabilidade e reprodutibilidade dos protocolos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes espécies de peixes ou matrizes de ração.
- As limitações da correlação in vitro-in vivo devem ser consideradas ao interpretar os resultados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:31
In Vitro Solubility of Supplemented Zn in Atlantic Salmon
1:33
Cell Harvest and Preparing for Exposure Experiments
2:49
Apparent Availability of Dietary Zn in Atlantic Salmon (Salmo salar)
3:13
Results: Mineral Availability in Fish Feeds
4:23
Conclusion
