Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus
24 de maio de 2020
Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.
As técnicas de microinjeção de embriões abriram caminho para o desenvolvimento de inúmeras ferramentas de controle de vetores de base genética. Embora numerosas espécies de insetos tenham protocolos já bem desenvolvidos, Culex quinquefasciatus permanece relativamente pouco estudado. Este protocolo de microinjeção foi projetado especificamente para acomodar as características biológicas únicas de Culex quinquefasciatus, incluindo coleta de ovos, separação de jangadas de ovos e procedimentos pós-injeção.
Este método provavelmente pode ser adaptado a qualquer espécie de Culex de interesse e pode ser usado para estudar a função do gene ou para gerar tecnologias de controle baseadas em genética para espécies de Culex. Comece separando os ovos das jangadas. Use uma pinça ou um pincel para pressionar a jangada e separar os ovos individuais.
Alinhe os ovos em uma tira fina de fita adesiva dupla face colocada na parte superior de uma lâmina de vidro, fazendo um esforço para apontar o lado anterior de cada ovo na mesma direção. Prepare a mistura de halocarbono misturando suavemente os reagentes de halocarbono com água e incubando a mistura a 25 graus Celsius durante a noite. Cubra os ovos alinhados com a mistura de óleo halocarbônico.
Para gerar agulhas para as microinjeções, coloque um vidro capilar de aluminossilicato em um extrator de agulhas, seguindo as instruções do fabricante. Defina o calor para 560, a velocidade para 100, o atraso para 70, a tração para 97 e a pressão para 500. Em seguida, ative o extrator de agulhas.
Toque suavemente a ponta da agulha puxada na placa abrasiva diamantada rotativa por cerca de 10 segundos em um ângulo de 50 graus para chanfrar a ponta da agulha. Incorpore agulhas puxadas e chanfradas em linhas de argila de modeladores em uma placa de Petri. Preparar a mistura de injecção constituída por reagentes de modificação do genoma e conservá-la no gelo.
Use uma ponta de microcarregador para carregar dois microlitros de mistura de injeção na agulha de injeção. Coloque a agulha de injeção cheia em um micromanipulador ligado a um microinjetor eletrônico e coloque a lâmina de vidro com os ovos alinhados no palco de um microscópio composto. Usando o micromanipulador, alinhe a agulha para mirar na extremidade posterior do embrião em um ângulo de 25 a 35 graus.
Insira cuidadosamente a agulha no embrião e injete a mistura em uma quantidade de cerca de 10% do volume do embrião. Injete 20 óvulos de cada vez, depois pare e execute os procedimentos de recuperação do embrião. Dentro de 20 minutos após a injeção, remova cuidadosamente o óleo de halocarbono dos ovos, escovando-os levemente com um pincel limpo.
Levante os ovos com o pincel e coloque-os em um copo de água bidestilada Nos próximos sete dias, verifique os ovos diariamente quanto à eclosão e siga os procedimentos normais de criação de larvas. Rastreie os mosquitos injetados para os fenótipos mutantes usando um estereoscópio.
Este método tem sido usado para gerar com sucesso mutações somáticas e germinativas de um gene crítico para o desenvolvimento da pigmentação do olho escuro. As mutações somáticas geradas por CRISPR-Cas9 foram pontuadas pela triagem de perda de pigmentação nos olhos do estágio pupilar de indivíduos injetados. As mutações somáticas estavam geralmente presentes como fenótipos em mosaico, onde algumas, mas não todas, as células têm o fenótipo mutante.
As taxas de mutação da linha germinativa foram determinadas pelo cruzamento de indivíduos G zero em mosaico e pontuação por prole de olhos completamente brancos. Esses experimentos resultaram em uma taxa de sobrevivência embrionária de 64 a 82%, uma taxa de mutagênese somática de 37 a 57% e uma taxa de mutagênese germinativa superior a 61%. Ao multiplexar sgRNAs para atingir vários loci no mesmo gene, as taxas de mutagênese somática e germinativa aumentaram para até 86% Além disso, por muitas gerações, estoques homozigotos viáveis dos mutantes brancos foram mantidos com sucesso no laboratório.
Para otimizar as taxas de sobrevivência e mutagênese, todos os materiais, incluindo óleo de halocarbono, fluido de injeção e agulhas, devem ser preparados adequadamente antes de tentar microinjeções. Isso permitirá um processo de microinjeção mais simplificado e focado.
Visão Geral
Este protocolo descreve técnicas de microinjeção para embriões de Culex quinquefasciatus, otimizadas para edição genética com CRISPR/Cas9. Ele permite a geração eficiente de mutações germinativas herdáveis para pesquisas genéticas e tecnologias de controle de vetores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia genética
- Biologia de vetores
- Tecnologia CRISPR/Cas9
Contexto
- Culex quinquefasciatus é um vetor de doenças pouco estudado.
- Técnicas de microinjeção são cruciais para o desenvolvimento de ferramentas de controle genético.
- Protocolos existentes para outras espécies de insetos são bem estabelecidos.
- Este método acomoda as características biológicas únicas das espécies de Culex.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo de microinjeção para Culex quinquefasciatus.
- Facilitar estudos de função gênica e tecnologias de controle genético.
- Otimizar as taxas de sobrevivência e de mutagênese em embriões injetados.
Métodos Utilizados
- Técnicas de coleta de ovos e separação de jangadas.
- Preparação de óleo de halocarbono e mistura para injeção.
- Microinjeção de embriões utilizando um micromanipulador.
- Triagem de fenótipos mutantes após injeção.
Resultados Principais
- Taxa de sobrevivência de embriões alcançou 64-82%.
- As taxas de mutagênese somática variaram de 37-57%.
- As taxas de mutagênese na linhagem germinativa ultrapassaram 61%.
- A multiplexação de sgRNAs aumentou as taxas de mutagênese para 86%.
Conclusões
- O protocolo gera com sucesso mutações somáticas e germinativas.
- Estoques viáveis de mutantes homozigotos foram mantidos no laboratório.
- A preparação adequada dos materiais melhora o processo de microinjeção.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microinjeção eficiente de embriões permite a mutagênese específica de sítio em Culex quinquefasciatus, um vetor-chave para doenças como o vírus do Nilo Ocidental e a filariose linfática. Essa capacidade apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, gerando mutações herdáveis para estudos funcionais de genes. O protocolo aborda barreiras específicas da espécie, melhorando a confiança preditiva na identificação de alvos para o controle de vetores e no desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da eliminação precisa de genes em um vetor inseto relevante para a doença.
- Valor Operacional: Oferece um método reprodutível para gerar mutações na linhagem germinativa, permitindo a validação funcional de alvos envolvidos na transmissão de patógenos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar a interrupção gênica a desfechos fenotípicos essenciais para a capacidade vetorial.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz resultados quantificáveis de mutagênese (taxas somáticas e germinativas) para avaliar a eficiência de edição entre diferentes designs de RNA guia.
- Valor Operacional: Padroniza o manuseio de embriões e as condições de injeção, melhorando a reprodutibilidade do ensaio entre diferentes lotes experimentais.
- Escalabilidade: Permite a entrega multiplexada de sgRNA para aumentar as taxas de mutagênese, apoiando a triagem em alta produtividade de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Gera mutantes de olho branco hereditários para estabelecer linhagens genéticas estáveis para estudos fenotípicos e de transmissão de longo prazo.
- Valor Operacional: Alcança taxas de sobrevivência de embriões entre 64–82%, garantindo quantidade suficiente de mutantes viáveis para triagem fenotípica subsequente.
- Continuidade Translacional: Mantém estoques viáveis de mutantes homozigotos ao longo das gerações, apoiando a avaliação pré-clínica de estratégias de controle genético.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a hipótese sobre um alvo até a identificação de uma molécula inicial, ao permitir a genômica funcional em uma espécie vetorial pouco estudada.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio de mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 para esclarecer a função gênica em interações patógeno-vetor.
- Triagem: Fornece taxas quantitativas de mutagênese (37–57% somáticas, >61% germinativas) para comparar a eficácia de RNAs guia e otimizar condições de edição.
- Análises: Permite a pontuação de fenótipos mutantes por meio de triagem estereoscópica, fornecendo resultados mensuráveis para validação de alvos.
- Pesquisa Translacional: Facilita a continuidade do descobrimento gênico ao desenvolvimento de modelos pré-clínicos, gerando linhagens mutantes estáveis.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado de microinjeção adaptável entre espécies de Culex, reduzindo o desenvolvimento redundante de protocolos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao permitir a ligação direta entre genótipo e fenótipo em um modelo de doença transmitida por vetores.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de alinhamento de ovos, aplicação de sobreposição com halocarboneto e preparação de agulhas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer validação funcional de alvos essenciais para a sobrevivência do vetor ou transmissão do patógeno.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em taxas de mutação herdáveis e gravidade fenotípica.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manuseio de embriões, micromanipulação e análise fluorescente ou estereoscópica.
- Depende da preparação do puxador de agulhas, microinjetor e óleo de hidrocarboneto para a viabilidade dos embriões.
- Necessita padronização entre equipes nas técnicas de coleta de ovos e separação de jangadas.
- A adaptação entre espécies de Culex pode exigir ajustes no volume de injeção e na geometria da agulha.
- As limitações práticas incluem a fragilidade dos embriões e a necessidade de recuperação imediata após a injeção para manter as taxas de sobrevivência.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
