Replicação biomimética da microestrutura da superfície raiz usando alteração da litografia macia
5 de agosto de 2020
A biomimética tem sido usada anteriormente como uma ferramenta para estudar interações folha-microrganismo. No entanto, não existe tal ferramenta para raízes. Aqui, desenvolvemos um protocolo para formar superfícies sintéticas imitando microestrutura de superfície raiz para o estudo de interações ambiente raiz.
Este protocolo permite desenvolver um sistema sintético imitando a microestrutura da superfície radicular. O sistema pode ser usado para estudar interações root-environment de forma controlada com ênfase na estrutura da superfície. Esta é uma técnica simples que pode ser realizada em qualquer laboratório que estuda interações root-environment.
Além disso, essa técnica permite a formação da superfície a partir de diversos materiais. O passo mais difícil é a remoção da raiz natural do molde negativo. Esta etapa requer um manuseio suave da raiz para evitar rasgar os pelos da raiz.
A demonstração visual aumentará a capacidade do espectador de replicar este procedimento. Comece removendo a planta do solo após três semanas de crescimento. Corte o sistema radicular da planta no ponto de interação com o caule e coloque a planta sem raízes em um béquer com água.
Depois de alguns dias, corte as raízes aventuriosas que emergem do caule e use-as para replicação. Para preparar raízes germinadas de sementes, molhe um papel filtro dentro de uma placa de Petri com água e coloque várias sementes M82 no papel. Incubar o prato a 25 graus Celsius e hidratar o papel todos os dias.
Aproximadamente cinco dias depois, as raízes germinadoras serão longas o suficiente para serem usada para replicação. Prepare a solução de réplica negativa adicionando 9,49 gramas de dimeretida de diuretano a um copo de 50 mililitros. Adicione 1,45 mililitros de metacrilato etílico ao copo e armazene à temperatura ambiente até que a solução se torne homogênea e pareça clara.
Adicione três mililitros do plastificador e mexa a solução por mais uma hora. Em seguida, adicione 300 microliters do iniciador de fotos e mexa durante a noite ou até que todas as bolhas sejam removidas. Para gerar a réplica negativa da raiz, pegue um slide de vidro limpo e despeje um mililitro da solução de réplica negativa sobre ela.
Coloque de duas a três raízes sobre a solução, certificando-se de que as raízes não estão totalmente cobertas. Mantenha o slide sob uma lâmpada ultravioleta de oito watts por oito a 10 minutos e, em seguida, desligue a lâmpada UV. Retire a réplica do deslizamento de vidro e coloque-a em uma placa de Petri cheia de etanol para remover o monômero não redigido.
Use fórceps para remover lentamente e suavemente a raiz da réplica. Para preparar a solução PDMS para a réplica positiva, coloque 10 gramas de dimetil siloxano em um copo. Adicione um grama de agente de cura e misture bem.
Aqueça a mistura em um desiccador sob vácuo por duas horas para remover bolhas de ar. Coloque a réplica negativa de poliuretano em uma placa de Petri e despeje a mistura de PDMS em cima da réplica negativa. Aplique vácuo por duas horas para garantir a cobertura da microestrutura e mantenha a placa de Petri em temperatura ambiente durante a noite.
No dia seguinte, separe a réplica positiva curada da réplica negativa usando fórceps. Para preparar a réplica positiva da celulose etil, adicione 20 mililitros de etanol a um copo de 100 mililitros. Em seguida, adicione 1,32 mililitros de plastificador e 3,3 gramas de celulose etil.
E mexa a solução em temperatura ambiente por duas horas. No dia seguinte, despeje a solução de celulose etil em cima da réplica negativa em uma placa de Petri e deixe a placa sob o capô durante a noite. Em seguida, remova lentamente a réplica positiva da réplica negativa com fórceps.
Uma boa réplica negativa pode ser gerada se o protocolo for seguido corretamente. Esta réplica mostrará a estrutura celular da superfície radicular, bem como buracos representando a localização dos pelos da raiz. Se a raiz estiver submersa na solução de poliuretano, ela ficará presa no polímero duro e permanecerá dentro da réplica negativa depois de curada.
Ao curar com a luz UV, excedendo o tempo de cura recomendado, resultará em um molde de poliuretano extremamente duro, tornando impossível remover a raiz sem quebrá-la. Às vezes, as peças de raiz são tão pequenas que a microscopia é necessária para vê-las. Réplicas positivas foram geradas com PDMS e celulose etílico.
Os pelos radiculares estão na zona de alongamento onde começam a emergir. Seus comprimentos variam ao longo da superfície radicular à medida que se tornam mais longos, semelhantes à raiz natural. Alguns dos cabelos da réplica de celulose etil são mesmo visíveis sob o microscópio de luz.
Ao colocar a raiz sobre a solução de réplica negativa, é importante escolher o lado direito e evitar a submersão da raiz dentro da solução. Essa técnica foi desenvolvida para fornecer um novo caminho para a pesquisa de interações no ambiente da superfície raiz. Especificamente, as forças físicas causadas pela microestrutura e propriedades materiais da superfície.
Visão Geral
Este protocolo permite o desenvolvimento de superfícies sintéticas que imitam a microestrutura da superfície radicular, facilitando estudos controlados das interações entre raiz e ambiente. A técnica é simples e pode ser realizada em qualquer laboratório voltado para estudos de raízes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biomimética
- Biologia Vegetal
- Micrestrutura Radicular
Antecedentes
- Estudos anteriores utilizaram biomiméticos para investigar as interações folha-micro-organismo.
- Nenhuma ferramenta existente estava disponível para estudar as interações radiculares.
- Este estudo preenche essa lacuna por meio da criação de superfícies radiculares sintéticas.
- O protocolo enfatiza a importância da estrutura da superfície em estudos sobre raiz-ambiente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um sistema sintético que imite a microestrutura da superfície radicular.
- Permitir estudos controlados das interações entre raiz e ambiente.
- Fornecer uma técnica replicável para pesquisadores em biologia vegetal.
Métodos Utilizados
- Extração de raízes de plantas e preparação de moldes negativos.
- Uso de dimetacrilato de diuretano e metacrilato de etila para a criação de réplicas negativas.
- Preparação de réplicas positivas utilizando PDMS e etilcelulose.
- Demonstrações visuais para auxiliar na replicação do procedimento.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de réplicas negativas e positivas de superfícies radiculares.
- As réplicas representam com precisão a estrutura celular e a localização dos pelos radiculares.
- Demonstrou a viabilidade do uso de diversos materiais para replicação de superfícies.
- Forneceram insights sobre as forças físicas que afetam as interações entre raiz e ambiente.
Conclusões
- Essa técnica abre novas perspectivas para pesquisas sobre interações na superfície radicular.
- Permite estudos detalhados dos efeitos da microestrutura no comportamento da raiz.
- Pesquisas futuras podem se basear neste protocolo para explorar diversos fatores ambientais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma biomimética permite a investigação controlada dos efeitos da microestrutura da superfície radicular sobre interações microbianas, abordando uma lacuna crítica na pesquisa sobre plantas e microrganismos. Ao replicar arquiteturas delicadas de pelos radiculares em materiais sintéticos, o método possibilita a eliminação mecanicista de hipóteses relativas a processos biológicos mediados por superfícies. A abordagem fornece um sistema escalável e reutilizável para avaliar como características físicas da superfície influenciam a colonização microbiana e a secreção de enzimas em fluxos de trabalho de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar as relações estrutura-função nas interações raiz-microorganismo ao isolar a topografia da superfície como uma variável independente.
- Valor Operacional: Fornece superfícies sintéticas reprodutíveis para testes de hipóteses consistentes entre réplicas experimentais.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera modelos microestruturais quantificáveis para avaliação padronizada da adesão microbiana e atividade enzimática.
- Valor Operacional: Permite versatilidade de materiais (PDMS, celulose etílica) para ajustar as propriedades da superfície conforme objetivos específicos de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o rastreamento da localização de microrganismos em relação a características definidas da superfície, permitindo a correlação entre microestrutura e resultados funcionais, como a secreção de celulase.
- Valor Operacional: Oferece uma opção de etilcelulose com capacidade de degradação para modelar alterações dinâmicas da superfície em estudos pré-clínicos de desafio microbiano.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método posiciona-se na fase de descoberta biológica, permitindo a geração de hipóteses sobre comportamentos microbianos mediados por superfícies antes de esforços de triagem de compostos ou otimização de compostos líderes.
- Biologia de Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao permitir a variação sistemática da densidade de pelos radiculares e das características da zona de alongamento para testar sua influência no comportamento microbiano.
- Triagem: Produz superfícies padronizadas e replicáveis para avaliação de alta fidelidade das interações microbianas sob condições superficiais controladas.
- Análises: Permite o mapeamento espacial da localização de microrganismos em relação à microestrutura da superfície, fornecendo leituras quantitativas baseadas em imagens para estudos de interação.
- Pesquisa Translacional: Conecta a análise de microestrutura na fase de descoberta à validação pré-clínica por meio de superfícies biomiméticas que refletem a arquitetura radicular nativa.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma tecnologia de plataforma aplicável a múltiplas espécies vegetais e sistemas microbianos, reduzindo o desenvolvimento redundante de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de raiz-micróbio ao dissociar a estrutura da superfície de variáveis químicas e biológicas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de moldagem e replicação compatíveis com equipamentos laboratoriais convencionais.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nas decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer modelos preditivos de superfície que reduzem a dependência de amostras naturais variáveis.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos microbianos ou compostos com base em perfis de interação dependentes da estrutura.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos vegetais e em técnicas de litografia macia para a geração bem-sucedida do molde.
- Exige equipamento de cura UV e dessecador a vácuo para a produção de réplicas livres de bolhas.
- Exige protocolos padronizados de preparação de raízes para garantir a captura consistente da microestrutura entre diferentes lotes.
- Envolve compromissos na seleção de materiais entre a durabilidade do PDMS e a biodegradabilidade da etilcelulose, conforme os objetivos específicos do estudo.
- Limitado pela necessidade de extração suave das raízes para preservar as estruturas delicadas dos pelos radiculares durante a criação do molde negativo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Root Preparation
1:37
Preparation of the Root Negative Replica from Polyurethane
2:47
Preparation of the Root Positive Replica from PDMS and Ethyl Cellulose
4:05
Results: Microscopy Images of Negative and Positive Replica
5:14
Conclusion
