Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton
25 de fevereiro de 2021
O protocolo aqui apresentado descreve o uso do Spotiton, um novo sistema robótico, para entregar duas amostras de interesse em uma grade de nanofios que se misturam por um mínimo de 90 ms antes da vitrificação em criogen líquido.
Usando o sistema robótico Spotiton, pode-se misturar e vitrifar uma proteína de interesse com um parceiro interagindo em uma grade de microscópio eletrônico em até 90 milissegundos. Este protocolo permite a captura de confirmações de proteínas intermediárias que são muito transitórias para serem capturadas por técnicas padrão de preparação da grade. O spotiton resolvido pode informar sistemas biológicos ou bioquímicos sub-segundo, como ativação de canais de membrana, síntese de DNA ou RNA, ou interação precoce de uma droga ou anticorpo com sua proteína alvo.
O usuário deve gerenciar simultaneamente vários componentes que impactam diretamente na qualidade de uma rede. É importante entender o sistema antes de usar e ter paciência na preparação de grades. Para começar, abra a válvula principal no tanque de fornecimento de nitrogênio e garanta que o reservatório do sistema esteja cheio de água ultrapura desabotada.
Ligue o computador e o sistema Spotiton na tira de energia de várias tomadas. Clique no ícone da área de trabalho para abrir a interface de usuário do software Spotiton. No menu Ferramentas, selecione Estágios de Inicialização para inicializar e abrigar os robôs de três eixos e o conjunto rotativo da cabeça do dispensador, garantindo que as pontas do dispensador estejam apontando para baixo antes da inicialização e do homing.
No menu principal, clique em Ir para Posição Segura para enviar os robôs para a posição segura. Na guia Aspirar, selecione Prime para lavar as cabeças do distribuidor várias vezes com água do reservatório. Continue até que dois fluxos ininterruptos de água possam ser vistos saindo das pontas.
Na guia Inspecionar, envie a dica um para a câmera de inspeção e teste a água de fogo, ajustando a amplitude até que gotículas discretas sejam produzidas. Pressione o botão Gravar no monitor da câmera superior para gravar um vídeo de uma ponta disparando. Mande a dica dois para a câmera de inspeção.
Reprodugue o vídeo da ponta um disparando no monitor do lado direito ao mesmo tempo que a ponta dois é disparada no monitor da câmera superior, combinando com o padrão de produção de gotículas dos dois distribuidores. Remova as pinças do suporte do robô da grade usando a chave Allen fornecida. Em uma bancada próxima, posicione um lado nanofio da grade de teste na borda do bloco de grade.
Pegue cuidadosamente a borda da grade e posicione-a corretamente na pinça. Então remonte a pinça. Na guia Cryo, clique em Ponta para Câmera para mover uma dica para o campo de visão da câmera do caminho de mergulho superior, garantindo que o Live seja selecionado no monitor da câmera superior.
Ligue e ajuste a luz superior da câmera. Posicione a ponta um visível no monitor da câmera superior, clicando no mouse dentro do monitor. Clique em Grade para Câmera para posicionar a grade na frente da câmera superior e, em seguida, ajuste a posição da ponta uma novamente, se necessário.
Na guia Cryo, certifique-se de que a Grade Vitrificada não está selecionada, clique em Alvo de Fila e, em seguida, em Plunge. Avalie as imagens superiores e inferiores para confirmar que os distribuidores estão funcionando normalmente. Diluir duas amostras às concentrações desejadas com um buffer apropriado, idealmente usando o mesmo para ambos, e encha a tigela de criogen com nitrogênio líquido.
Plasma limpa três a quatro grades de nanofios usando hidrogênio e oxigênio de cinco watts, e 1,5 minutos como ponto de partida. Conecte o nebulizador e observe a saída de vapor da porta central da tampa do nebulizador. Observe o Monitor de Umidade Ao Vivo na janela principal ou abra o Rastreador de Umidade Ambiente sob Relatórios e Ambiente.
Verifique os níveis de umidade nas zonas de câmara e mortalha. Adicione cinco microliters de cada amostra nos copos de amostra. Coloque os copos de amostra na bandeja de retenção com uma amostra para a ponta um à esquerda e para a ponta dois à direita.
Em seguida, empurre a bandeja de volta para a máquina até que ela se aconte bem. Na guia Aspirar, selecione três microliters para que o volume seja aspirado por cada ponta. Certifique-se de que a bandeja de amostra foi sentada com segurança, clique em Aspirar e observe o estágio da pipeta mova as cabeças do distribuidor para os copos de amostra.
Verifique a aspiração bem sucedida de ambas as amostras removendo os copos de amostra e observando uma queda nos níveis líquidos. Na guia Inspecionar, envie cada dica para a câmera de inspeção para confirmar a dispensa não estruturada. Ajuste a amplitude conforme necessário para combinar a formação de gotículas de cada ponta.
Coloque uma grade limpa de plasma recém-plasma nas pinças, mas não monte as pinças ainda. Certifique-se de que o nível de umidade seja elevado para aproximadamente 90 a 95% Preencha o copo de etano e realize um teste final de fogo de ambas as pontas em frente à câmera de inspeção, confirmando nenhuma obstrução. Na guia Cryo, clique em Ponta para Câmera.
Verifique a xícara de etano. Se o gelo de etano se formou, derreta conforme necessário com gás de etano adicional. Monte a pinça com a grade no palco da grade.
Na aba Cryo, clique em Grade para Câmera, garantindo que a ponta esteja posicionada corretamente no monitor da câmera superior. Clique em Grade Vitrificada, Alvo da Fila e, em seguida, Mergulhe. Clique em OK quando solicitado a comandar o robô de grade para saltar a grade do etano em nitrogênio líquido e soltá-lo na prateleira submersa.
Examine as imagens da grade para decidir se ela deve ser mantida ou descartada. Se manter a grade, fórceps pré-frios de ponta fina, segure suavemente a grade pela borda e coloque-a em uma ranhura de caixa de grade, começando com o primeiro slot à esquerda do entalhe e indo no sentido horário. Use o Visualizador de Experimentos para revisar e comparar as imagens da grade das câmeras superiores e inferiores, juntamente com as configurações da máquina e as medidas de umidade no momento da queda, selecionando Relatórios e Experimentos.
Imagens de grades preparadas durante uma única sessão spotiton resolvida por tempo único misturando polimerase RNA em um oligômero de DNA de 105 pares base carregando uma sequência de promotores por 150 milissegundos antes da vitrificação são mostrados aqui. Das seis grades, apenas uma mostra pavio subótimo. O padrão de deposição de gelo em uma grade vitrificada combina de perto com o padrão de líquido depositado visto na imagem da câmera superior.
A umidade eficaz das amostras mistas ocorre ao longo das barras de grade cobertas de nanofios onde a amostra raramente transborda em quadrados adjacentes àqueles em que pousou. Em quadrados cheios de gelo, o gelo é tipicamente mais grosso dentro de buracos no centro do quadrado e torna-se mais fino em buracos mais próximos às barras de grade. Os orifícios imediatamente adjacentes às barras de grade são muitas vezes vazios, devido à proximidade com os nanofios.
A preparação e manuseio adequados das grades de nanofios garantirão uma boa espessura de gelo em grades de amostra mista. O sistema Spotiton também permite que o usuário deposite as duas amostras separadamente em uma única grade, permitindo a coleta de um controle não misturado durante a mesma sessão de manutenção da rede. Spotiton permitiu a captura dos primeiros intermediários na expressão genética bacteriana em tempo real.
Por se formarem em uma escala de tempo sub-segundo, suas estruturas são desconhecidas até agora.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para o uso do sistema robótico Spotiton na realização de estudos de microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) com resolução temporal. O sistema Spotiton permite a mistura rápida e a vitrificação de biomoléculas interagentes em grades de microscopia eletrônica com nanofios, possibilitando aos pesquisadores capturar estados moleculares transitórios que ocorrem em escalas de tempo inferiores ao segundo. O protocolo enfatiza o diagnóstico de problemas e a otimização da preparação das grades para obter resultados de alta qualidade com volume mínimo de amostra.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia eletrônica criogênica (crio-EM)
- Biologia estrutural
- Bioquímica
Contexto
- Capturar intermediários moleculares de curta duração é um grande desafio na microscopia crioeletrônica.
- Métodos tradicionais de preparação de grades frequentemente perdem estados conformacionais transitórios.
- São necessárias abordagens com resolução temporal para estudar processos biológicos rápidos, como a ativação de canais de membrana, síntese de ácidos nucleicos e interações iniciais entre fármacos e seus alvos.
- Spotiton é um sistema robótico projetado para enfrentar esses desafios, permitindo mistura precisa e rápida de amostras e vitrificação.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo passo a passo para operar o sistema Spotiton em estudos de criomicroscopia eletrônica com resolução temporal.
- Destacar estratégias de solução de problemas para questões comuns durante a preparação das grades.
- Demonstrar a capacidade do sistema em capturar estados moleculares transitórios.
Métodos Utilizados
- Preparação e inicialização do sistema robótico Spotiton e do software.
- Calibração e sincronização de dispensadores piezelétricos duplos para deposição precisa de gotículas.
- Limpeza com plasma e manipulação de grades de microscopia eletrônica de nanofios.
- Mistura rápida e vitrificação de duas amostras em uma grade em tão pouco quanto 90–150 milissegundos.
- Avaliação da qualidade da grade utilizando ferramentas de imagem e rastreamento de experimentos.
Resultados Principais
- O protocolo permite a mistura e vitrificação de amostras em uma escala de tempo suficientemente rápida para capturar conformações proteicas intermediárias.
- Uma absorção eficaz e a formação de gelo são alcançadas ao longo das barras da grade de nanofios, com espessura ideal de gelo na maioria dos quadrados da grade.
- O sistema permite a deposição de amostras mistas e não mistas (controle) em uma única grade.
- O Spotiton possibilitou a captura em tempo real de intermediários anteriormente não observáveis na expressão gênica bacteriana.
Conclusões
- O sistema Spotiton oferece um fluxo de trabalho robusto e eficiente para estudos de criomicroscopia eletrônica com resolução temporal.
- A configuração, calibração e manipulação adequadas são fundamentais para a preparação de grades de alta qualidade.
- Essa abordagem abre novas possibilidades para o estudo de eventos biomoleculares rápidos e transitórios em alta resolução.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Capturar intermediários moleculares transitórios é um desafio crítico na descoberta precoce de fármacos e na biologia estrutural. O sistema robótico Spotiton permite a preparação de grades para microscopia crioeletrônica com resolução temporal, possibilitando que equipes de pesquisa e desenvolvimento investiguem interações biomoleculares rápidas e mudanças conformacionais com alta precisão temporal. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e apoia decisões de portfólio ajustadas ao risco em pontos críticos de inflexão da descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a observação direta de conformações proteicas de curta duração relevantes para o engajamento do alvo.
- Auxilia na desmistificação mecanicista ao capturar estados intermediários em interações proteína-ligante ou proteína-ácido nucleico.
- Facilita a validação funcional do alvo ao revelar transições estruturais em escalas de tempo subsegundo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara grades biológicas validadas para análise crioeletrônica com volume mínimo de amostra.
- Padroniza a preparação de grades para obtenção de dados estruturais reprodutíveis e quantitativos.
- Permite produção rápida e escalável de grades para suportar triagem em alto rendimento de interações moleculares.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha imagens estruturais com mecanismos relevantes para doenças, orientando estratégias translacionais de biomarcadores.
- Proporciona continuidade desde descobertas iniciais de insights mecanicistas até a validação em modelos pré-clínicos.
- Reduz ambiguidades no planejamento de fármacos baseado em estrutura ao capturar estados intermediários difíceis de detectar.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema Spotiton integra-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos promissores, conectando fluxos de trabalho de investigação mecanicista com validação estrutural.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a captura de eventos moleculares rápidos e transições de vias.
- Triagem: Fornece grades de criomicroscopia eletrônica reprodutíveis e quantitativas para análise comparativa dos efeitos de compostos ou biomoléculas.
- Análises: Fornece dados estruturais de alta resolução para orientar comparações de condições e hipóteses mecanicistas.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas estruturais iniciais à validação pré-clínica ao estudar sistemas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalável para uso repetido em diversos programas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece preparação padronizada, reprodutível e escalonável de grades para estudos estruturais.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e o progresso eficiente em termos de capital dos ativos de descoberta.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao revelar estados transitórios críticos para a função biológica.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de grades de criomicroscopia eletrônica e operação de sistemas robóticos.
- Requer acesso à instrumentação Spotiton e grades de nanofios para microscopia eletrônica compatíveis.
- Exige calibração rigorosa e padronização entre equipes para resultados reprodutíveis.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes sistemas biomoleculares ou tipos de amostras.
- A qualidade da grade é sensível ao controle de umidade, calibração do dispensador e protocolos de preparação da amostra.
