Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente
28 de março de 2021
As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simp
Glioma stem As células-tronco são sub-população de células no glioma, que geralmente são resistentes à quimioterapia e radioterapia. Aqui descrevemos o método de identificação rápida de terapias combinadas, visando células-tronco glioma, em vez de células glioma diferenciadas. Comparado com outros métodos, o que pode ser um trabalhoso e complicado.
Este protocolo é relativamente simples e rápido, para identificar potenciais combinações de drogas úteis. Comece coletando as células-tronco de glioma ou GSCs do meio de cultura, e centrifugando-as a 70 vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Depois de remover o supernante, digerir as células com accutase por quatro minutos a 37 graus Celsius.
Usando uma ponta de 200 microliter, pipeta as células repetidamente para dissociar, e resuspensar a pelota celular. Adicione os GSCs a uma densidade de 200.000 células em um mililitro de cultura média, em cada poço de uma placa de cultura de 12 poços, e incuba-los durante a noite. Oh no dia seguinte, adicione 30 microliters de luciferase-eGFP vírus supernante em cada poço da placa.
Centrifugar as células a 1000 vezes G por duas horas, a 25 graus Celsius e incuba-las durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio nos poços coletando os GSCs, centrifugando-os, removendo o supernascimento, reutilizando-os em meio fresco e ressuculando-os. Cultue as células por mais 48 horas.
Observe a placa sob um microscópio fluorescente e confirme o aparecimento de células GFP positivos. Classifique e colete os GSCs com uma alta fluorescência usando um classificador de células de fluxo e cultuá-los ainda mais. Cubra, 96 placas de fundo ópticas com uma mistura de matriz extracelular, como o matrigel, e incuba-as por uma hora a 37 graus Celsius.
Remova a mistura em excesso e enxágue suavemente as placas uma vez com PBS, em seguida, sementes células XG387-Luc a uma densidade de 1000 células em 100 microliters de meio cultura, e para cada poço das placas revestidas e cultuá-las durante a noite. No dia seguinte, observe as células sob um microscópio para confirmar sua ligação com a placa. Em seguida, prepare uma solução de 200 temozolomidas de micromolar e duas soluções micromolar dos agentes alvos, no meio da cultura.
Para a triagem combinada de drogas, remova o meio em branco e adicione o meio contendo 200 temozolomida micromolar ou dois agentes-alvo micromolar, ou uma combinação de ambos, em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias. Tire imagens da bioluminescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS.
Usando o software embutido, crie várias áreas circulares da região de interesse e quantifique a bioluminescência celular. Para identificar potenciais candidatos que poderiam aumentar o efeito antiglioblastoma do temozolomide, 20 inibidores seletivos de pequenas moléculas foram analisados através da triagem de combinação de drogas. Os valores de índice sensíveis de 13 agentes-alvo estavam acima de zero e cinco deles acima de 0,1.
O índice sensível das duas principais drogas candidatas UMI-77 e A 83-01, foram superiores a 0,25, sugerindo seu potencial de sinergizar com temozolomide. O tratamento combinado de temozolomida e UMI-77 foi avaliado utilizando um ensaio anti-proliferativo em uma matriz de titulação de seis por seis doses. Os valores do índice de combinação foram inferiores a um.
E os altos valores de agente único foram maiores que zero para a maioria das combinações de temozolomide e UMI-77 em diferentes concentrações. Sugerindo uma interação sinérgica geral de temozolomide e UMI-77 em GSCs XG387 e XG328. Este protocolo também pode ser aplicado em encontrar combinação de drogas usando células cancerígenas aderentes, simplesmente removendo a etapa de revestimento da placa.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo simplificado para a identificação rápida de combinações de fármacos com efeito sinérgico direcionadas às células-tronco de glioma (GSCs) no glioblastoma (GBM). O fluxo de trabalho utiliza GSCs marcadas com luciferase, placas revestidas com matrigel e triagem de alto rendimento baseada em bioluminescência para avaliar a eficácia de terapias combinadas, com o objetivo de superar a resistência das GSCs aos tratamentos convencionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do câncer
- Pesquisa com células-tronco
- Descoberta de fármacos
- Neuro-oncologia
Antecedentes
- As células-tronco de glioma são uma subpopulação dentro dos tumores de glioblastoma, contribuindo para a iniciação tumoral, angiogênese e resistência à terapia.
- As CTCs são altamente refratárias a terapias direcionadas com agente único, exigindo o desenvolvimento de tratamentos combinados.
- Os métodos tradicionais de triagem de fármacos em CTCs são frequentemente trabalhosos e complexos.
- São necessários protocolos de triagem rápidos e eficientes para identificar combinações eficazes de fármacos contra as CTCs.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um fluxo de trabalho simples e rápido para triagem de combinações medicamentosas com potencial sinérgico direcionadas às CSGs.
- Validar a capacidade do protocolo em identificar combinações que potencializem o efeito anti-glioblastoma das terapias convencionais.
- Demonstrar a aplicabilidade do protocolo tanto para CSGs quanto para células cancerígenas aderentes.
Métodos Utilizados
- Isolamento e cultivo de células-tronco de glioma a partir de linhagens celulares estabelecidas.
- Transdução de CTCs com vírus luciferase-eGFP para imagem de bioluminescência.
- Classificação de CTCs positivas para GFP utilizando citometria de fluxo.
- Plaqueamento de CTCs em placas de 96 poços revestidas com matrigel para triagem de fármacos.
- Tratamento com temozolomida, agentes direcionados ou suas combinações em réplicas técnicas.
- Quantificação da bioluminescência celular utilizando o sistema de imagem IVIS Spectrum e análise da sinergia medicamentosa por meio dos valores de índice de sensibilidade e índice de combinação.
Resultados Principais
- Vinte inibidores de moléculas pequenas direcionados foram testados em combinação com temozolomida.
- Treze agentes apresentaram valores positivos de índice de sensibilidade, sendo que cinco superaram 0,1.
- UMI-77 e A 83-01 demonstraram a maior sinergia com a temozolomida (índice de sensibilidade > 0,25).
- Os valores do índice de combinação para temozolomida e UMI-77 foram inferiores a um, indicando efeitos anti-proliferativos sinérgicos em múltiplas linhagens de CSG.
Conclusões
- O protocolo descrito permite a identificação rápida e eficiente de combinações de fármacos com sinergia direcionada às CSGs.
- UMI-77 e A 83-01 são candidatos promissores para terapia combinada com temozolomida no GBM.
- Este fluxo de trabalho pode ser adaptado para uso com células cancerígenas aderentes mediante a omissão da etapa de revestimento da placa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação rápida de combinações de fármacos sinérgicos direcionadas às células-tronco de glioma (GSCs) aborda um gargalo crítico no desenvolvimento de terapias para glioblastoma (GBM). Este fluxo de trabalho permite triagem quantitativa de alto rendimento para reduzir os riscos associados a estratégias de combinação contra células iniciadoras de tumor altamente resistentes. A integração dessa triagem no início do processo favorece a confiança preditiva e a seleção de portfólios para GBM e outros cânceres refratários.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas focadas em mecanismos de resistência mediados por CSG.
- Apoia a desmistificação biológica ao testar diretamente a sinergia de fármacos em populações de células-tronco relevantes para a doença.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de leituras quantitativas de viabilidade e proliferação.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de regimes de combinação em portfólios de GMB.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas GSC validados com marcação por luciferase para fluxos de trabalho robustos de triagem subsequente.
- Padroniza as condições do ensaio utilizando placas revestidas com matrigel e réplicas técnicas para garantir reprodutibilidade.
- Gera saídas quantitativas de bioluminescência para avaliação e comparação confiáveis de compostos.
- Permite triagem escalonável e de alto rendimento de múltiplas combinações de fármacos em paralelo.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha os resultados do triagem com a biologia de CSGs relevantes para a doença, garantindo continuidade translacional.
- Permite o avanço de terapias combinadas ajustado ao risco em modelos pré-clínicos de GMB.
- Oferece desvio mecanicista de riscos ao confirmar sinergia em múltiplas linhagens de CSG derivadas de pacientes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de triagem conecta a fase inicial de descoberta e a identificação de compostos líderes, permitindo uma avaliação rápida e quantitativa da sinergia medicamentosa em células-tronco gliomatosas derivadas de pacientes. Os resultados orientam a priorização pré-clínica e estratégias de biomarcadores translacionais para terapias combinadas em glioblastoma.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias na resistência mediada por CSGs.
- Triagem: Fornece dados quantitativos reprodutíveis de bioluminescência para triagem de compostos.
- Análises: Fornece valores sensíveis de índice e índice de combinação para comparar sinergia entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém a relevância para a doença utilizando CSGs derivados de pacientes e protocolos adaptáveis para células cancerígenas aderentes.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e escalonável para triagem de combinações em portfólios de oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista no desenvolvimento de terapias combinadas.
- Valor Operacional: Otimiza a triagem com fluxos de trabalho padronizados, escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avançar/não avançar e maior eficiência de capital ao focar em combinações sinérgicas precocemente.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de terapias promissoras para GBM.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de CSG, transdução viral e citometria de fluxo para separação celular.
- Necessita de acesso a sistemas de imagem de bioluminescência e software analítico para leituras quantitativas.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de montagem do ensaio e análise de dados.
- Adaptável a outros modelos de câncer mediante modificação dos passos de revestimento da placa e preparação celular.
- Depende da disponibilidade de linhagens de CSG derivadas de pacientes e bibliotecas de compostos validadas.
