Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase
13 de abril de 2022
Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.
Este protocolo torna possível rotular proteínas de uma maneira específica do tipo celular. Esta é a primeira técnica que oferece tal possibilidade e pode ser feita in vitro ou in vivo. A principal vantagem da técnica é que as proteínas específicas do tipo celular marcadas podem ser purificadas não identificadas ou visualizadas in situ por imunofluorescência.
Para começar a preparar o lisado de tecido, adicionando tampão de lise a um volume de 12 a 15 vezes o peso úmido do tecido e triturar o tecido até que ele seja homogeneizado. Aqueça este homogeneizado por 15 minutos a 75 graus Celsius para desnaturar a proteína, em seguida, centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius.
Em seguida, para alquilação, diluir a amostra homogeneizada duas a três vezes em tampão salino fosfato contendo um inibidor de protease livre de EDTA. Em seguida, adicione a iodoacetamida recém-preparada a uma concentração final de 20 milimoles. Deixe a amostra por uma a duas horas a 20 graus Celsius no escuro.
Repita as etapas de adição e incubação de iodoacetamida duas vezes. Prepare a coluna de acordo com as instruções do fabricante, primeiro vórtice as colunas. Em seguida, retire a tampa cortando a parte inferior e centrifugando-a.
Em seguida, execute uma troca de buffer primeiro equilibrando as colunas de troca de buffer usando o buffer de troca química de clique e, em seguida, trocando todas as amostras alquiladas. Para avaliar a incorporação de azidonorleucina pegue 40 microlitros da amostra aludida e adicione tampão salino fosfato a um volume final de 120 microlitros. Em seguida, configure a reação química do clique vortexing a reação por 20 segundos.
Depois de adicionar cada reagente na ordem indicada o mais rápido possível, incubar as amostras no escuro a quatro graus Celsius durante a noite com rotação contínua. No dia seguinte, centrifugar as amostras por cinco minutos a 17.000 vezes G após a centrifugação, um pellet ligeiramente turquesa será visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e armazene a amostra a menos 80 graus Celsius.
Para purificação de proteína marcada. Submeter todas as amostras a um procedimento de troca de tampão, conforme demonstrado para limpar as sobras de alquino livre usando o tampão de ligação de neutravidina como tampão de equilíbrio. Em seguida, lave as contas de alta capacidade de neutravitina três vezes, misturando as contas com o tampão de ligação.
Centrifugar a mistura, descartar o sobrenadante e repeti-lo três vezes. Em seguida, prepare uma pasta um-para-um, adicionando o mesmo volume de contas secas de neutravidina e tampão de ligação de neutravidina. Reserve 20 a 40 microlitros de cada amostra como lisado pré-purificado e armazene-o a menos 20 graus Celsius.
Após a medição da concentração de proteína da amostra, misture um miligrama de proteína com 40 microlitros da pasta de miçangas. Incubar a mistura durante a noite a quatro graus Celsius com rotação contínua, permitindo que as proteínas marcadas se liguem às contas. No dia seguinte, recolher o sobrenadante por centrifugação.
Separe uma alíquota de 20 a 40 microlitros do sobrenadante para análise posterior e congele o restante a menos 80 graus Celsius. Em seguida, lave as contas três vezes adicionando um tampão de lavagem de neutravidina refrigerado. Sedimentar as contas e descartar o sobrenadante.
Em seguida, adicione o mesmo tampão e incube as contas por 10 minutos sob rotação contínua a quatro graus Celsius antes de descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem com tampões de lavagem de neutravidina dois e três e eluir as proteínas clicadas incubando as contas por 30 minutos a 20 graus Celsius com um volume de tampão de eluição de neutravidina, correspondente a um volume das contas secas utilizadas. Durante a eluição, mantenha as contas em suspensão a 1000 rotações por minuto em um agitador de bloco térmico iludir duas vezes e combinar ambas as eluidas.
As reações de cliques foram analisadas por SDS page e Western immuno blot. Imagens representativas dos experimentos são mostradas para a administração de azidonorleucina por injeção intraperitoneal e para a administração de azidonorleucina via água potável. Um outro experimento fornece um exemplo para a determinação da concentração ideal de alcina clivável de biotina dissulfureto.
Neste exemplo, a mudança de dobra entre a amostra rotulada e o controle é maior na concentração de alquino micromolar 14. Um exemplo de um resultado de espectrometria de massa com um claro enriquecimento na amostra marcada com azidonorleucina em comparação com o controle é mostrado aqui. Essa diferença já era visível na coloração proteica total.
Além das mudanças na intensidade do peptídeo, há também proteínas únicas encontradas em ambas as amostras. Este é um protocolo tecnicamente complexo e é um passo que deve ser cuidadosamente seguido usando alquilação de controles negativos adequados, limpeza adequada (indistinta) e adequada do arquivo não clicado. Nossos principais passos neste protocolo, as proteínas purificadas podem ser identificadas por espectrometria de massa se o interesse dos pesquisadores é estudar proteínas ou carregá-las em um gel para estudar proteínas de interesse por western blot.
A capacidade deste método de marcar proteínas de uma origem celular específica tem muitas aplicações, como a tensão de proteínas ou o estudo da síntese proteica in vitro ou in vivo.
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Visão Geral
Este protocolo descreve uma abordagem inovadora para marcação proteica específica por tipo celular utilizando azidonorleucina (ANL) com um modelo murino que expressa uma tRNA sintetase de metionina mutante L274G (MetRS*). A técnica permite a marcação, purificação e visualização de proteínas in vitro e in vivo, facilitando o estudo da síntese proteica e da função celular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Química de Proteínas
Contexto
- Este protocolo permite a marcação seletiva de proteínas específicas de certos tipos celulares.
- Ele inclui aplicações tanto in vitro quanto in vivo.
- O uso de azidonorleucina representa um avanço nas técnicas de marcação de proteínas.
- A imunofluorescência pode ser utilizada para visualizar proteínas marcadas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método para o isolamento de proteínas específicas de tipos celulares.
- Fornecer etapas detalhadas para marcação e purificação de proteínas.
- Aprimorar a análise da síntese proteica em diversos contextos celulares.
Métodos Utilizados
- O estudo envolve um modelo de camundongo que expressa MetRS* para marcação proteica.
- Os passos detalhados incluem preparação de lisado tecidual, alquilação e procedimentos de purificação utilizando esferas de neutravidina.
- Reações de química click são empregadas para avaliar a incorporação de azidonorleucina.
- Os protocolos para as vias de administração de ANL, por água de beber e por via intraperitoneal, são descritos.
Resultados Principais
- A marcação bem-sucedida de proteínas foi demonstrada por meio de diversas técnicas de purificação.
- Uma distinção clara em amostras marcadas foi observada, indicando incorporação eficaz de azidonorleucina.
- Os principais achados incluem a identificação de proteínas únicas possivelmente associadas aos processos biológicos em estudo.
- O protocolo enfatiza controles rigorosos e execução cuidadosa para garantir confiabilidade.
Conclusões
- Este estudo fornece um protocolo único e complexo para o estudo de proteínas específicas de tipo celular.
- A capacidade de rotular proteínas oferece informações valiosas sobre mecanismos celulares e síntese proteica.
- Os achados podem aprimorar nosso entendimento de diversas funções biológicas e modelos de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A marcação e purificação específicas de proteínas por tipo celular utilizando a linhagem de camundongos MetRS* permite a investigação precisa de alterações proteômicas em tecidos complexos, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Essa abordagem reduz a complexidade da amostra, permitindo a identificação de pequenas alterações proteômicas relevantes para doenças e intervenções terapêuticas. O método aumenta a confiança preditiva em pontos críticos de inflexão no processo de descoberta, possibilitando a medição direta de proteínas recém-sintetizadas em populações celulares definidas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a avaliação direta da dinâmica da síntese proteica em tipos celulares específicos dentro de tecidos heterogêneos.
- Apoia a validação funcional de alvos ao isolar alterações proteômicas associadas a perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Facilita a desmistificação mecanicista ao esclarecer as contribuições dos tipos celulares em vias relevantes para doenças.
- Aprimora a confiança preditiva para o engajamento de alvos e os efeitos biológicos downstream.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece proteomas validados e específicos para cada tipo celular para o desenvolvimento de ensaios e fluxos de trabalho de triagem.
- Permite a medição quantitativa e reprodutível de proteínas recém-sintetizadas para padronização de ensaios.
- Permite escalabilidade e reutilização da plataforma ao permitir aplicações tanto in vitro quanto in vivo.
- Melhora a confiabilidade da avaliação de compostos ao reduzir o sinal de fundo proveniente de tipos celulares não-alvo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha resultados proteômicos com populações celulares relevantes para doenças, visando a descoberta de biomarcadores translacionais.
- Permite continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica, rastreando a síntese proteica in vivo.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo dados proteômicos resolvidos por tipo celular.
- Aumenta a desvinculação preditiva na pesquisa translacional ao esclarecer os mecanismos celulares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e a pesquisa pré-clínica, fornecendo uma plataforma reutilizável para análise proteômica específica de tipo celular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a marcação seletiva de proteínas em populações celulares definidas.
- Triagem: Fornece resultados proteômicos quantitativos e reprodutíveis para preparação de ensaios e triagem de compostos.
- Análises: Oferece leituras por espectrometria de massa e imunoblot para comparar perfis proteômicos entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas da fase inicial a modelos pré-clínicos ao permitir o rastreamento da síntese proteica in vivo.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalável para uso repetido em diversos programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho proteômicos padronizados, reprodutíveis e escalonáveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avançar/não avançar e maior eficiência no uso de capital, ao esclarecer os efeitos específicos ao tipo celular.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas de descoberta.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em proteômica, genética de camundongos e técnicas de química click.
- Requer acesso à espectrometria de massa, imunoblotagem e reagentes especializados de marcação.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes e controles negativos para garantir a confiabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos de tecidos ou sistemas modelo com base na complexidade celular.
- A complexidade técnica e a necessidade de execução cuidadosa são fundamentais para resultados reprodutíveis.
