De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olá, meu nome é Matt Lui. Sou pesquisador pós-doutorando no laboratório de Leslie Sal na Universidade Rockefeller. E hoje gostaria de contar a vocês sobre os experimentos que temos realizado para estudar a quimiotaxia larval.

O problema em que estamos interessados é bastante simples. Ele está, de fato, representado aqui nesta montagem. Acabei de transferir um grupo de larvas de Joseph para esta superfície de agros.

Esse ambiente é bastante hostil e eles estão quase morrendo de fome. De alguma forma, esses animais precisarão encontrar o caminho até a fonte de alimento mais próxima, e aqui há uma banana emitindo cheiro que atrairá as larvas. Esse ambiente não é ideal para estudar o comportamento de quimiotaxia, portanto a primeira melhoria será substituir a banana por uma substância química.

Este composto químico é o acetato de isoamila e é um dos sabores predominantes na banana. Assim, este é o nosso aroma artificial, e ao utilizá-lo temos um controle muito melhor do estímulo olfativo. A próxima melhoria consiste em usar um ambiente fechado e tentar impedir, dessa forma, as flutuações na distribuição do odor.

Então, aqui está o ensaio que temos usado no laboratório por bastante tempo. Este é um disco de Petri com uma superfície de agarro na base. O agarro é ideal para larvas em ataques quimiotáticos porque mantém a umidade delas.

Nos dois lados da placa, você encontra outra tampa feita de teflon, e o que vamos fazer agora é introduzir acetato de isômero em um lado e nada no outro lado. Uma vez feito isso, a ideia é fechar a placa de Petri, aguardar um pouco para o odor difundir e, em seguida, abrir o recipiente. Introduzimos um animal aqui e deixamos o animal se mover por um determinado período de tempo.

Este ensaio baseia-se na suposição de que, ao introduzir o teodor em um lado da placa, forma-se um gradiente que se estabelece de forma razoavelmente rápida e permanece estável durante o período do teste. O principal problema agora é que ninguém jamais demonstrou que o gradiente realmente existe na placa. Pode muito bem ocorrer que, logo após a adição do teodor, haja uma distribuição homogênea do teodor na placa, de modo que o gradiente seja muito pouco acentuado, ou então que vários minutos sejam necessários para que o gradiente se estabeleça.

Isso dependerá, é claro, principalmente da pressão de vapor do odor que está sendo utilizado. A segunda questão está relacionada ao que é quantificado durante o experimento. Imagine que um animal parte daqui, o X, e após três minutos é encontrado nesta placa final, o X vermelho. Agora existem duas abordagens possíveis.

Uma coisa que você pode fazer é registrar apenas a posição final do animal após um determinado período de tempo, três ou cinco minutos. Então, a única informação que você obteria seria a posição inicial e final, e acreditamos que é importante ter uma boa resolução sobre o comportamento do animal ao longo do tempo. Por exemplo, um animal poderia ter se movido muito pouco da posição inicial até a posição final, como aqui, ou poderia ter visitado muito bem a região ao redor de theodor por uma parte significativa do tempo e retornado antes do fim do ensaio.

A conclusão que extrairíamos dessas duas situações é muito diferente. Em um caso, o animal pode não ter respondido ao estímulo, enquanto no outro caso certamente respondeu. As duas melhorias que tentamos alcançar são, em primeiro lugar, controlar a forma e a estabilidade do outro gradiente na arena.

Em segundo lugar, acompanhe o comportamento do animal em tempo real e mantenha todas essas informações. Na próxima sequência, Sylvia vai apresentar como preparamos a diluição em série. Meu nome é S ti.

Sou assistente de pesquisa no laboratório do VAs, trabalhando com o material lui. Hoje vou mostrar como preparar os materiais para o sistema de câmara que utilizamos para rastrear animais. O principal problema com o nosso sistema de câmara é que estamos utilizando odor disperso no ar.

Isso significa que, por exemplo, se as placas de ágar que utilizamos não estiverem planas, você poderá obter flutuações e variações de concentração entre experimentos, o que introduzirá ruído no sistema. Então, vou mostrar a você e dar algumas dicas para tentar reduzir o ruído no sistema. Os materiais necessários para preparar a diluição do odor são um frasco de vidro, preferencialmente de vidro escuro, caso esteja utilizando odores reativos à luz, com uma alíquota do odor de seu interesse.

Pipetas de vidro para preparar esta alíquota e uma pipeta mecânica adequada. Em seguida, ponteiras para pipeta com óleo de parafina, seu pipetador padrão e pequenos frascos para a diluição. Mais uma vez, estes precisam ser de vidro e, preferencialmente, escurecidos, além de uma balança para realizar medições precisas e reduzir ruídos entre experimentos.

Como os odores são altamente voláteis e alguns deles são tóxicos, os procedimentos são realizados dentro de uma capela. O primeiro passo para preparar uma diluição de odor é aliquotar o odor que será diluído. Para preparar diluições precisas e minimizar a variação entre experimentos, é necessário pesar todos os componentes.

Então, comece rotulando, vamos preparar uma concentração de um molar de butirato de etila. Primeiro, prepare o óleo de parafina. O óleo de parafina é muito viscoso, portanto é importante tentar mergulhar a ponta da pipeta o mínimo possível no óleo de parafina, apenas o suficiente para conseguir aspirar o óleo sem gerar bolhas.

Então, é recomendável remover o excesso de óleo de parafina na lateral do frasco. Mais uma vez, como o óleo de parafina é viscoso, é muito importante deixá-lo escoar lentamente para o vial. Depois de pipetar o óleo de parafina no seu frasco, não descarte a ponteira imediatamente, pois mais líquido irá se acumular na ponta inferior da ponteira.

É recomendável preparar uma planilha de cálculos antes de iniciar a diluição, na qual você já tenha medido o volume de óleo de parafina que irá adicionar, bem como o peso, e faça o mesmo também para o seu odor, incluindo o peso. Dessa forma, você pode verificar na balança todo o óleo de parafina necessário e todo o odor também. Se necessário, despeje mais óleo de parafina e meça novamente até obter o peso correto.

Uma vez que você tenha o peso correto do óleo de parafina, tudo o que precisa fazer é adicionar o odorizante usando os mesmos princípios. Muito bem. Aqui vou mostrar como preparar larvas para rastreamento.

Normalmente utilizamos larvas com seis dias de idade. Fazemos isso porque elas são grandes o suficiente para serem facilmente detectadas pelo nosso software e também ainda estão muito ativas. Para verificar se suas larvas estão muito velhas para uso no rastreamento, basta verificar se há larvas subindo pelas paredes. Se houver larvas subindo pela parede, então estão muito velhas e não serão particularmente ativas.

O primeiro passo no preparo de suas larvas é mergulhá-las em sacarose a 15%. A razão pela qual usamos sacarose a 15% é que as larvas flutuarão nesta solução, enquanto o alimento irá se dissolver parcialmente nela ou afundar até o fundo. Despeje quantidade suficiente de sacarose para que fique a cerca de, sei lá, um pouco menos de 2,5 cm do topo do seu frasco ou tubo.

Em seguida, pegue uma espátula. Você já pode ver as larvas subindo à superfície e, delicadamente, escave a comida para soltar os animais que estiverem enterrados nela, movimente um pouco para separá-los da comida e, então, deixe repousar por alguns minutos. Assim que a comida e as larvas estiverem adequadamente separadas, pegue uma placa de Petri previamente rotulada e despeje-as na parte do coletor.

Mantenha a tampa da placa de Petri, pois você irá preenchê-la com água e utilizá-la como recipiente para as larvas rastreadas, permitindo distinguir quais já foram rastreadas e quais ainda não foram. Agora que você despejou as larvas na placa de Petri, é necessário esperar 30 minutos para que se adaptem à sacarose e alcancem um estado de privação alimentar. Isso significa que elas se comportarão melhor durante o período de rastreamento, enquanto as larvas se adaptam.

O açúcar é um bom momento para preparar as placas para rastreamento. Estas são tampas de placas de 96 poços. Você pode comprá-las separadamente, e esta é uma solução de agarose a 3% que já foi aquecida.

Utilizamos 3% porque impede que as larvas cavedem, mas também é suficientemente densa para permitir que caminhem sobre ela e permaneçam umidificadas na superfície de cada placa. É necessário pipetar 25 mL de ágar. É importante tentar evitar a formação de bolhas grandes no gel.

É igualmente importante colocar as placas sobre uma superfície plana, caso contrário, você poderá obter géis em ladeira, o que pode afetar o comportamento das larvas. Após o aros ter solidificado, empilhamos as tampas e as envolvemos com filme plástico para evitar que sequem. Isso deve mantê-las em boas condições para rastreamento por vários dias.

Nesta sequência, vou apresentar a você nosso ensaio comportamental, que difere ligeiramente do ensaio em placa de Petri, sobre o qual lhe falei anteriormente. O que você precisará são tampas de placas de 96 poços, bem como aquelas contendo a camada de ágar. Os ensaios são compostos por três tampas, que são empilhadas.

O primeiro compartimento não contém nada, está vazio e é usado apenas para isolar o sistema da superfície sobre a qual ele repousa. A segunda camada contém a superfície de ágar Diego. Aqui, os animais serão colocados sobre a superfície e, como mostrarei a seguir, introduzimos o teodor na placa.

É importante usar uma tampa nova e fresca toda vez que você carregar o theodor. Isso serve para evitar qualquer contaminação de um experimento para outro. Você também precisará de outra diluição.

Normalmente não usamos um corante para carregar o theodor, mas aqui farei uso dele para fins de ilustração. Esta é uma alta concentração de theodor. Enquanto esta está muito diluída, meu objetivo será criar um gradiente ao longo de uma linha.

Diga esta linha e queremos ter uma concentração crescente da esquerda para a direita. Para alcançar isso, usarei várias gotas em ordem colocadas no anel de condensação com concentração crescente. Começo com a concentração mais alta, que será colocada na extremidade.

É importante dispersá-lo no anel. Agora prosseguirei com a próxima concentração, que é diluída duas vezes em comparação com a primeira, e a coloco neste anel. Então, não, tenho seis gotas.

O primeiro contém uma concentração de, digamos, um. O segundo tem concentração de 0,5, duas vezes menor que a do primeiro. O terceiro tem concentração de 0,25, e assim por diante.

Assim, temos uma série geométrica ao longo da linha. O próximo passo consiste em inverter esta tampa sobre a superfície do AAL e, agora, por tensão superficial, todas as gotículas permanecem suspensas na parte superior da tampa. Desenvolvemos uma técnica baseada em espectroscopia no infravermelho para medir toda a concentração na placa.

Ao aplicar esta técnica, foi possível demonstrar que, se houver uma série geométrica ao longo da linha de desodorante aqui, obtém-se uma concentração de odorante ao longo do comprimento que aumenta exponencialmente, conforme mostrado aqui, e ao longo da largura da placa. Temos um perfil que atinge um pico exatamente abaixo da linha de odorante. Veja como é a geometria real do gradiente.

Se considerarmos a concentração de teodor no ar, o aspecto positivo é que conseguimos demonstrar que o gradiente de sua geometria é estável por pelo menos 15 minutos. Após a colocação da tampa superior, aguardamos 30 segundos para permitir que o gradiente se estabeleça. Em seguida, introduzimos o animal na arena.

O animal é introduzido sob a outra linha final entre as posições três e quatro; utilizamos um pequeno alfinete para transferir as larvas da solução de sacarose para a superfície do ágar. A transferência é feita pescando uma larva ao redor da cabeça do alfinete. Abrimos rapidamente a tampa e depositamos a larva sobre a superfície do ágar.

Em seguida, fechamos a tampa. É importante minimizar o tempo em que a tampa permanece aberta. Depois, registra-se o movimento do animal por três ou cinco minutos.

O registro real é realizado. Com esta configuração de rastreamento, temos uma câmera conectada a um computador. O software de rastreamento de imagem que estamos utilizando é o Aton Vision da Nordis, para coletar as informações sobre o movimento do animal e armazená-las como um arquivo digital.

Agora estamos prestes a iniciar o experimento comportamental. Temos a tampa com a camada de aro. Temos as diluições.

Diego está preso na primeira tampa. Antes de carregar o theodor, é importante agitar cada frasco em vórtex. Utilizamos nossa diluição com a menor à esquerda e a maior à direita.

Todas as seis gotas serão carregadas na placa ao mesmo tempo. Para evitar a perda de odor, estamos utilizando aqui uma pipeta multicanal com seis ponteiras; 10 microlitros do odor são retirados de cada amostra de diluição, e o odor é carregado simultaneamente. Após o carregamento, a tampa é colocada invertida sobre a superfície do ágar.

O gradiente foi criado na placa ao longo dos últimos 30 segundos, como mostrei anteriormente. Agora vou introduzir um animal na superfície de Diego. Assim que o animal for introduzido, inicio a gravação.

O animal está aqui e seu movimento está sendo rastreado. Como é possível observar, o animal está seguindo a linha do odorante e se dirigindo ao ponto de maior concentração do gradiente. Lembre-se de que a concentração aumenta da esquerda para a direita com uma forma exponencial.

Como é possível observar, a direção do movimento é constantemente corrigida. Em relação ao estímulo, o animal agora alcançou o ponto de maior concentração do gradiente, e o removemos da placa. O animal é descartado em outra placa para garantir que não rastrearemos o mesmo indivíduo duas vezes consecutivamente.

Depois de introduzirmos uma nova larva e iniciarmos uma nova gravação, estas são as regras que seguimos para o rastreamento. Interrompemos o rastreamento assim que o animal atinge a fileira de maior concentração da placa, que corresponde a esta, esta aqui. Além disso, se um animal atinge a parede, o rastreamento é interrompido porque queremos evitar qualquer interferência.

A primeira questão que abordamos foi bastante simples. O que queríamos saber era se um animal poderia cheirar odores em uma determinada concentração. Para realizar tal teste, o que normalmente fazemos é utilizar uma única fonte de odor, em vez de várias.

Isso permite que você tenha um grau de liberdade para alterar a concentração na gota final de Theodor. Assim, por exemplo, aqui você tem uma gota de alta concentração, e aqui você tem uma gota de baixa concentração. O que geralmente fazemos é introduzir o animal na superfície de Diego exatamente abaixo da gota de Theodor e verificar se o animal é capaz de detectar sua presença e permanecer em sua vizinhança.

Agora gostaria de fazer um uso mais avançado do nosso ensaio. Imagine que você tem uma gota de ordem e registra várias trajetórias que estão sobrepostas aqui, e você tem três delas. Você tem um indivíduo que gera esta trilha verde.

Você tem esta trilha laranja que é menos centralizada, e depois tem esta trajetória rosa que representa um animal aparentemente circulando em torno da fonte. Acreditamos que há muitas informações para começar sobre os detalhes das trajetórias. Por esse motivo, importamos a trajetória como uma série de posições para o Matlab e realizamos a análise após a análise com o Matlab.

Aqui está a distância até a fonte, provavelmente em função do tempo. Para as três trajetórias exibidas anteriormente, tem-se a trajetória verde, que permanece muito próxima da fonte. Tem-se também a trajetória laranja, que apresenta ruído significativamente maior.

Em seguida, tem-se esta trajetória roxa, que interessantemente mostrou que o animal deixou a fonte para permanecer a uma distância, o que provavelmente correspondeu a uma concentração que era ideal. Aqui se observa a ilustração de 10 trajetórias, de animais incapazes de sentir odores. Estes são mutantes ou mutantes três B, que são não olfativos.

E, como você pode ver, todas essas trajetórias ilustram que os animais não conseguiram detectar a fonte do odor e simplesmente a abandonaram. Agora, em nítido contraste, gravamos aqui 10 trajetórias consecutivas de animais com tique branca. Esses animais são, é claro, capazes de sentir o cheiro, e, como você pode ver, todos eles se acumulam exatamente sob a fonte do desodorante.

As 20 trajetórias, que acabaram de ser apresentadas, foram na verdade adquiridas sem conhecimento da identidade dos animais. Isso demonstra a eficiência e confiabilidade do nosso ensaio. Ao determinar se alguns Mutantes são ou não capazes de sentir odores aqui utilizando um gradiente Exponencial, geramos várias trajetórias e queremos ter uma noção de quão bem os animais são capazes de seguir o estímulo na outra extremidade.

Então, vou mostrar a você agora 15 trajetórias registradas separadamente, e como você pode ver, os animais fazem um excelente trabalho ao seguir o estímulo sob a linha final. Agora gostaríamos de prosseguir com um controle simples. Pode muito bem ser que os animais no gradiente exponencial tenham seguido a linha porque havia algum estímulo independentemente de sua concentração, apenas os animais seguiram em linha reta.

Assim, para demonstrar que eles estão de fato calculando a concentração ou algo relacionado à concentração e utilizando essa informação para orientar seu movimento, utilizamos agora esta geometria, próxima à forma de um telhado em duas águas. A larva é introduzida aqui como de costume, e o que esperamos é que ela se mova ao longo da linha e, em seguida, detecte que a concentração está diminuindo após este ponto e retorne a ele. Realizamos o teste com cinco animais.

Nós coletamos as trajetórias e agora as estamos representando sobrepostas neste slide. Como é possível observar, os animais partiram daqui, moveram-se ao longo da linha, depois exploraram a região correspondente à maior concentração e permaneceram principalmente nela. Isso sugere fortemente que eles são capazes de calcular outras concentrações em tempo real utilizando o ensaio com fonte única.

Fomos capazes de formular principalmente uma grande pergunta. Um animal consegue detectar um odor em uma determinada concentração utilizando um dispositivo de múltiplas fontes? Assim, temos maior flexibilidade para alterar a forma do gradiente e determinar se o animal é capaz ou não de utilizar essas informações.

Gostaria de ilustrar essa ideia realizando um experimento simples. Nos gradientes que montamos até agora, tínhamos um formato exponencial ao longo da lente. Agora surge a pergunta: se desafiarmos os al de forma mais intensa, fazendo a concentração aumentar linearmente ao longo da lente, eles ainda serão capazes de encontrar o caminho até a outra extremidade?

Este gráfico representa os dois tipos de gradiente. Testamos o gradiente exponencial em roxo e o gradiente linear em verde. Este é o gradiente linear, e vou escrever as diferentes concentrações de acetato de isam diluindo óleo de parênquima.

Esta é uma série aritmética. Temos um gradiente linear que será estabelecido e, como pode ser visto, a inclinação é bastante suave em comparação com o gradiente exponencial aqui, onde a concentração nas extremidades também é de 0,5, mas aumenta até 0,03. A questão é: navi são capazes de realizar ataques quimiotáticos quando enfrentam um gradiente tão suave?

Aqui, a concentração real de acetato utilizada nas seis gotas para o gradiente exponencial e para o gradiente linear. Como é possível observar, embora as concentrações mais altas sejam iguais em ambos os casos para o gradiente linear, a concentração mais baixa aqui é relativamente alta. Realizamos o experimento com o gradiente linear, e 15 trajetórias são representadas aqui de animais do tipo selvagem, e acreditamos ser bastante evidente que esses animais foram capazes de detectar o gradiente linear e seguir esse sinal ao longo da linha de desodorante.

Portanto, acho que nosso ponto está claro. Antes de encerrar, gostaria de falar brevemente sobre as direções futuras para esta configuração de rastreamento. Embora esta configuração de rastreamento permita realizar diversas coisas interessantes, por exemplo, observar comportamentos complexos em larvas ao longo de um período maior, ela possui algumas limitações.

Por exemplo, você está limitado ao tamanho da sua placa, o que limita por quanto tempo é possível fazer o rastreamento e os comportamentos complexos que podem ser analisados. Assim, seria interessante se pudéssemos desenvolver um sistema em que a placa fosse maior ou em que não houvesse limitação pelas bordas de uma placa. Outro problema é que, com o software que temos atualmente, é difícil rastrear mais de um animal ao mesmo tempo, tornando impossível observar comportamentos populacionais em tempo real.

Outro aspecto interessante do comportamento que não podemos testar por meio desta configuração são os movimentos tridimensionais reais das larvas no espaço. Ao rastrear os animais, você observará que, por exemplo, quando elas alcançam uma gota de odor, podem levantar a cabeça ou movimentá-la em torno, tentando detectar alterações na concentração. Possivelmente isso não é viável com a nossa configuração atual, portanto seria interessante desenvolver algo que nos permitisse realizar isso.