Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma
13 de outubro de 2023
O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.
À medida que nosso conhecimento da biologia tumoral cresce e o interesse em entender os meandros de como as células interagem dentro do tumor e influenciam os resultados dos pacientes, a importância de analisar células heterogêneas em todo o microambiente tumoral também aumentou. O sequenciamento multioma, que permite a aquisição de RNA de célula única e o sequenciamento de ataque a partir da mesma célula de forma pareada proporciona um avanço significativo nesse sentido. No entanto, a qualidade dos dados obtidos nesses experimentos é altamente dependente da qualidade das condições experimentais e do material biológico inserido.
Este protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes de tumores sólidos para sequenciamento multioma usando a plataforma 10x Genomics. Este protocolo é confiável usando suspensões de célula única frescas ou congeladas. Fornecemos recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.
Neste protocolo, utilizamos espécimes de adenocarcinoma ductal de pâncreas humano, que são um foco do tipo tecido primário em nosso laboratório. O câncer de pâncreas representa um tipo de tumor altamente desmoplásico, que prenuncia tecidos e células relativamente pegajosos. Além disso, como os espécimes de tumores pancreáticos disponíveis para pesquisa também tendem a ser relativamente pequenos, esforços são feitos para maximizar a quantidade de células capturadas.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método confiável e otimizado para o isolamento de núcleos de espécimes de tumores sólidos para sequenciamento multi-ômico utilizando a plataforma 10x Genomics. Inclui recomendações sobre condições de dissociação do tecido e criopreservação de suspensões de células isoladas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Genômica
Contexto
- Compreender a biologia tumoral é fundamental para melhorar os resultados em pacientes.
- Analisar células heterogêneas no microambiente tumoral é algo cada vez mais importante.
- A sequenciação multi-ômica permite a aquisição pareada de RNA de única célula e sequenciação ATAC.
- A qualidade dos dados depende fortemente das condições experimentais e do material biológico.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para o isolamento de núcleos de tumores sólidos.
- Aprimorar a qualidade dos dados de sequenciamento multi-ômico.
- Facilitar a análise dos microambientes tumorais.
Métodos Utilizados
- Isolamento de núcleos de espécimes de tumores sólidos.
- Uso de suspensões de células únicas frescas ou congeladas.
- Recomendações para condições de dissociação de tecidos.
- Técnicas de criopreservação para suspensões de células únicas.
Principais Resultados
- Estabeleceu-se uma abordagem otimizada para o isolamento de núcleos.
- Resultados confiáveis obtidos tanto de amostras frescas quanto congeladas.
- Qualidade aprimorada dos dados para sequenciamento multi-ômico.
- Foram fornecidas diretrizes para o processamento de tecidos e criopreservação.
Conclusões
- O protocolo aumenta a confiabilidade do isolamento de núcleos de tumores.
- Ele contribui para o avanço das técnicas de sequenciamento multi-ômico.
- Estudos futuros podem se beneficiar de condições experimentais aprimoradas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento otimizado de núcleos de espécimes de tumores sólidos é essencial para gerar dados de sequenciamento multiômico de alta qualidade, impactando diretamente a confiabilidade das análises de heterogeneidade tumoral em oncologia translacional. Este protocolo aborda o desafio de extrair núcleos intactos de tecidos tumorais desmoplásicos frescos e congelados, permitindo um perfil multiômico robusto em nível de célula única. A preparação confiável de núcleos nesta etapa aumenta a confiança preditiva nos processos downstream de descoberta e desenvolvimento de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite interrogar com alta fidelidade a heterogeneidade das células tumorais no nível de célula única.
- Apoia a validação funcional de alvos ao preservar populações celulares diversas durante o isolamento.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da representação precisa do microambiente tumoral.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece preparações padronizadas de núcleos para ensaios reprodutíveis de sequenciamento multiômico.
- Garante consistência qualitativa e quantitativa no material de entrada para fluxos de trabalho subsequentes.
- Melhora a prontidão do ensaio ao acomodar amostras tumorais frescas e criopreservadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à descoberta translacional de biomarcadores ao permitir o perfilhamento pareado de RNA e acessibilidade da cromatina.
- Mantém a relevância para doenças ao capturar a complexidade dos microambientes de tumores sólidos.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, padronizando a qualidade da amostra de entrada.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de isolamento de núcleos está posicionado na interface entre o processamento de tecidos e a geração de dados multiômicos, conectando fluxos de trabalho de descoberta inicial e pesquisa translacional.
- Biologia Descoberta: Maximiza o poder de teste de hipóteses ao preservar a diversidade e integridade celulares.
- Triagem: Fornece núcleos reprodutíveis e de alta qualidade para ensaios escalonáveis de sequenciamento multiômico.
- Análise: Permite leituras quantitativas robustas para comparar estados celulares tumorais e paisagens de cromatina.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores ao apoiar análises pareadas de RNA e ATAC-seq em única célula.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado e adaptável para diversos tipos de tumores sólidos e condições de amostras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de biologia tumoral e validação de alvos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade em amostras tumorais frescas e congeladas.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de perda de dados ou introdução de artefatos na etapa de preparação da amostra.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco de programas de descoberta e translacionais em oncologia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissociação de tecidos e manipulação de núcleos para obter rendimento e qualidade ideais.
- Exige acesso a reagentes especializados, peneiras celulares e ferramentas de avaliação quantitativa.
- Necessita padronização entre equipes das condições de digestão e lise para garantir reprodutibilidade.
- Deve ser adaptado para diferentes tipos de tumores e tamanhos de amostra, especialmente em tecidos desmoplásicos.
- É essencial monitorar cuidadosamente a integridade nuclear para evitar artefatos na sequenciação subsequente.
