Isolamento, expansão e diferenciação de progenitores fibroadipogênicos do modelo de camundongo espinhoso
15 de novembro de 2024
Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência. As FAPs obtidas a partir deste protocolo podem ser efetivamente expandidas e diferenciadas para miofibroblastos e adipócitos.
Nossa visão abrangente é entender e compreender melhor a comunicação celular e o comportamento celular que levam à metástase tecidual e como os processos celulares são desregulados no reparo alimentar. Para isso, estamos usando vários modelos, dos quais um é o mouse espinhoso. Um dos principais problemas com esse novo modelo de mouse é a falta de ferramentas para estudá-lo.
Aqui, fornecemos um novo protocolo, que contém digestão enzimática confiável e coloração de anticorpos. Permitindo-nos classificar com sucesso os progenitores fibroadipogênicos e cultivá-los in vitro para uma análise mais aprofundada de seu destino. Testamos várias combinações e concentrações de enzimas, bem como vários anticorpos, e nosso método fornece referências para o protocolo mais confiável e robusto.
Como agora temos uma digestão enzimática confiável, continuaremos a testar outros marcadores e anticorpos para analisar com sucesso células endoteliais, pericitos, células imunes e células miogênicas.
Visão Geral
Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos-espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e triagem celular ativada por fluorescência. O método fornece digestão enzimática confiável e marcação com anticorpos para triagem eficaz e cultivo in vitro de FAPs.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Medicina regenerativa
- Pesquisa com células-tronco
Contexto
- Compreender a comunicação e o comportamento celular é crucial para a homeostase tecidual.
- Os progenitores fibroadipogênicos desempenham um papel significativo na reparação tecidual.
- O modelo do camundongo espinhoso apresenta desafios únicos devido à escassez de ferramentas de pesquisa.
- São necessários protocolos confiáveis para o estudo dos PFA neste modelo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo robusto para o isolamento de FAPs de camundongos espinhosos.
- Permitir análises adicionais da diferenciação de FAPs em miofibroblastos e adipócitos.
- Fornecer uma base para o estudo de outros tipos celulares no modelo de camundongo espinhoso.
Métodos Utilizados
- Dissociação enzimática do tecido muscular.
- Classificação ativada por fluorescência (FACS) para o isolamento de FAP.
- Teste de várias combinações e concentrações de enzimas.
- Utilização de múltiplos anticorpos para classificação eficaz.
Resultados Principais
- Isolamento e expansão bem-sucedidos de FAPs de camundongos espinhosos.
- As FAPs podem ser diferenciadas em miofibroblastos e adipócitos.
- Estabelecimento de um protocolo confiável de digestão enzimática.
- Referências para métodos robustos de coloração com anticorpos fornecidas.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido aprimora o estudo de FAPs em camundongos espinhosos.
- Estudos futuros podem explorar marcadores e tipos celulares adicionais.
- Este trabalho contribui para a compreensão dos mecanismos de reparo tecidual.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e expansão otimizados de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) a partir do modelo de camundongo-espinhoso preenchem uma lacuna crítica na pesquisa de medicina regenerativa, permitindo o estudo robusto dos mecanismos de reparo tecidual. Essa capacidade apoia esforços iniciais de descoberta voltados à comunicação celular, remodelação da matriz extracelular e biologia regenerativa comparativa. O protocolo aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de vias regenerativas e da comunicação celular em um modelo de mamífero altamente regenerativo.
- Apoia a validação funcional de alvos ao isolar e expandir FAPs para estudos mecanicistas subsequentes.
- Facilita a desmistificação biológica ao fornecer uma plataforma para comparar as respostas regenerativas do camundongo espinhoso e de Mus musculus.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece populações celulares validadas para ensaios padronizados in vitro de diferenciação e remodelação da matriz.
- Melhora a reprodutibilidade dos ensaios por meio de protocolos robustos de digestão enzimática e separação celular baseada em anticorpos.
- Permite a avaliação quantitativa das decisões de destino das FAP sob condições definidas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com sistemas relevantes para doenças ao modelar a reparação tecidual e fibrose em um contexto de mamífero.
- Apoia a descoberta translacional de biomarcadores ao permitir estudos comparativos de mecanismos regenerativos.
- Fortalece as decisões de avanço ajustadas ao risco para portfólios de medicina regenerativa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer um método confiável para o isolamento e expansão de FAPs para estudos mecanicistas, triagem e translacionais.
- Biologia da Descoberta: Avança os testes de hipóteses sobre o destino celular e remodelação da matriz em contextos regenerativos.
- Triagem: Fornece populações celulares reprodutíveis e bem caracterizadas para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição quantitativa dos resultados de diferenciação e da pureza da população celular.
- Pesquisa Translacional: Facilita a comparação entre espécies dos processos regenerativos e o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo reutilizável para o isolamento de tipos celulares adicionais a partir do modelo de camundongo-espinhoso.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos regenerativos e em estudos mecanicistas.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de isolamento e expansão celular para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao reduzir a ambiguidade biológica na pesquisa de estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de medicina regenerativa.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em citometria de fluxo, dissociação enzimática de tecidos e cultivo celular.
- Requer acesso a instrumentação de FACS e painéis de anticorpos validados.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de digestão e coloração para garantir reprodutibilidade.
- Pode exigir adaptação para outros tipos de tecidos ou espécies conforme a pesquisa se expande.
- Depende de otimização contínua para marcadores celulares e populações adicionais.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
1:13
Collection of Skeletal and Cardiac Muscles from Spiny Mouse for Isolating Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
2:46
Digestion of Mouse Skeletal and Cardiac Muscles for Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
5:01
Fluorescence‐Activated Cell Sorting and Culture of Fibro‐Adipogenic Progenitors (FAPs)
