Usando bibliotecas de visão computacional para simplificar a quantificação de núcleos

Desenvolvemos esse método para normalizar dados metabólicos de modelos celulares para ajudar a identificar mecanismos, sublinhar as adaptações musculares esqueléticas induzidas pela terapia de calor e, finalmente, melhorar a saúde metabólica entre pessoas com pré-diabetes.

Devemos contar núcleos para normalização experimental. A quantificação manual de núcleos apresenta desafios, incluindo viés do observador, tempo e variabilidade ao encontrar diferentes amostras ou condições.

Nosso programa é de código aberto, garante a usabilidade por cientistas com vários níveis de habilidades tecnológicas relacionadas à codificação e é validado para a tarefa específica de quantificar núcleos com rapidez e precisão.

Essa técnica nos permite validar objetivamente os mecanismos subjacentes ao efeito potencial da terapia de calor nos benefícios para a saúde muscular e mitocondrial de nosso recente estudo clínico financiado pelo NIA.

[Narrador] Para começar, inicie um navegador da Web em um sistema de computador, navegue até github.com e versões do contador de núcleos. Baixe a versão mais recente do arquivo chamado Count nuclei.zip. Na pasta Downloads, clique com o botão direito do mouse no arquivo zip e selecione Extrair tudo para extrair os arquivos para o local desejado no computador local. Em seguida, procure por CMD ou prompt de comando na barra de pesquisa para abrir um prompt de comando. Use o comando CD para alterar o diretório para o caminho do arquivo executável, que é o arquivo do aplicativo que acabou de ser extraído da pasta de download. Em seguida, pressione Enter para confirmar a alteração do diretório. Na próxima linha de comando, substitua path to images pelo caminho do arquivo para a pasta que contém as imagens a serem analisadas. Caminho para saída com o caminho do arquivo para a pasta onde o arquivo .csv deve ser salvo e results.csv com o nome de arquivo desejado para a saída. Um código de exemplo é mostrado na tela e os caminhos de arquivo para imagens e saída podem ser inseridos conforme mostrado nas aspas. Use results.csv como o nome do arquivo de resultados ou especifique outro. Em seguida, pressione Enter. Quando a próxima linha de comando for exibida, confirme se o processamento foi concluído. Verifique se os contornos e a planilha de resultados estão disponíveis no diretório de saída especificado. Inspecione visualmente os contornos e compare com as contagens para verificar a qualidade da contagem antes da normalização dos dados. Abra um navegador e navegue até o contador de núcleos no github.com. Clique no botão verde Código e selecione Baixar ZIP para baixar o repositório de código. Para Mac OS, clique no menu de arquivo na pasta Downloads e selecione Abrir para extrair os arquivos para o computador local. Navegue até a pasta extraída chamada nuclei_counter main, que contém o repositório de código. Salve a pasta em um local acessível e anote o caminho do arquivo em um documento de texto. Em seguida, pressione Command + barra de espaço para abrir o Spotlight. Em seguida, digite terminal no Spotlight e selecione o aplicativo de terminal. Use o comando CD para alterar o diretório para o caminho do repositório de código copiando e colando o caminho do arquivo do documento de texto e pressione Enter. Na próxima linha de comando, verifique se há um espaço após o cifrão. Em seguida, digite o comando fornecido e pressione Enter para instalar as bibliotecas necessárias e ativar o modo editável. Inclua a versão apropriada do Python imediatamente após pip, conforme mostrado sem um espaço. Digite o comando na tela na próxima linha de comando para alterar o diretório para o diretório principal do código-fonte, que é o contador de núcleos do CD, conforme mostrado na tela. Em seguida, digite o comando na tela substituindo os caminhos de arquivo conforme apropriado e pressione Enter. Quando a próxima linha de comando for exibida, confirme se o processamento foi concluído. Verifique se os contornos e a planilha de resultados estão disponíveis no diretório de saída especificado. Inspecione visualmente os contornos e compare com as contagens para verificar a qualidade da contagem antes da normalização dos dados. Todos os núcleos nas imagens geradas pelo programa automatizado foram delineados por contornos verdes sólidos, indicando que os núcleos foram contados com sucesso. A confiabilidade interavaliadores entre as duas contagens manuais foi excelente, com coeficiente de correlação intraclasse maior que 0,999 e valor de P menor que 0,0001. O programa automatizado demonstrou excelente confiabilidade quando comparado à contagem manual média com coeficiente de correlação intraclasse de 0,993 e valor de P menor que 0,0001. Excelente confiabilidade foi observada em todos os quartis de densidade celular com coeficientes de correlação intraclasse variando de 0,986 a 0,998, todos com valores de P inferiores a 0,0001. Áreas com vários núcleos agrupados ou áreas com um artefato como um halo não foram contadas com precisão pelo programa automatizado. Esses problemas potenciais, juntamente com as possíveis causas e etapas de solução de problemas para melhorar a qualidade da imagem e a precisão do fluxo de trabalho automatizado de quantificação de núcleos, estão listados na tabela na tela.