Técnicas eficientes para amostragem abrangente de tecidos acessíveis em Xenopus adultos

Este trabalho tem como objetivo criar um método replicável para coletar rapidamente o ventrículo cardíaco de Xenopus, tronco arterial, lobo esquerdo do fígado, vesícula biliar, pulmão, pâncreas, baço, laringe, esôfago, estômago, intestinos, testículos, corpo gorduroso, oviduto, rins pareados, plexo ciático, pele, timo e todo o olho em menos de uma hora. Um desafio experimental é otimizar o frescor do tecido. Por esse motivo, o protocolo foi projetado para ser concluído em menos de uma hora. Ao priorizar o frescor dos tecidos, esses tecidos podem ser usados para concluir análises bioquímicas de alta qualidade, como proteômica, minimizando o número de animais usados. No futuro, escreveremos um protocolo sobre tecidos de acesso mais difícil, como cérebro, músculo e osso.

[Instrutor] Para começar, posicione o sapo sacrificado para o procedimento de dissecção e prenda os membros. Usando uma tesoura de dissecação, corte a pele ao longo da linha média e, em seguida, lateralmente para criar dois retalhos de pele. Usando uma pinça, segure a linha alba e puxe-a para longe da cavidade celômica. Corte cuidadosamente a musculatura em direção à cabeça e crie duas abas da parede da cavidade. Reduza os ossos coracoides para obter melhor acesso ao coração. Estique o pericárdio, perfure-o e retire-o para expor as três câmaras cardíacas. Agora apare os oráculos na junção onde eles encontram o ventrículo e o tronco arterial. Use uma pinça para agarrar o ápice do ventrículo e corte-o logo abaixo de sua junção com o tronco arterial, deixando uma margem. Observando a bifurcação do tronco arterial, estique o tronco e corte os troncos aórticos logo após os pontos onde eles se dividem em arcos. Em seguida, segure o lábio do lobo esquerdo do fígado e levante-o suavemente para expor os ductos hepáticos e císticos. Faça uma amostra dos dois terços inferiores do lobo esquerdo abaixo desses anexos. Depois de identificar a vesícula biliar, agarre-a e puxe-a para longe do lobo direito do fígado e corte sua fixação. Em seguida, segure o ápice do pulmão e puxe-o esticado. Corte o pulmão no limite onde ele faz a transição para o brônquio. Remova o brônquio da laringe. Para a remoção do ovário, desloque os lobos ovarianos para seus respectivos lados para visualizar os locais de fixação ventrais aos rins. Usando uma tesoura, remova os ovários próximos aos rins sem causar danos. Em seguida, inspecione o lobo anterior do fígado, também conhecido como lobo mediano, e observe sua conexão com o duodeno através da mesentaria. Use uma tesoura de iridectomia para cortar o ligamento mesório e hepatoduodenal. A massa carnuda restante é o pâncreas e o ducto colédoco. Corte a conexão do pâncreas e do ducto colédoco do lobo anterior do fígado, deixando uma margem. Segure o estômago com uma pinça dentada e uma extremidade do pâncreas com uma pinça de tecido. Sob ampliação, provoque suavemente o pâncreas para longe do estômago. Em seguida, identifique o baço e faça uma amostra cortando sua fixação ao peritônio. Segure a laringe pela extremidade inferior e comece a levantá-la da cavidade, cortando quaisquer anexos peritoneais à medida que forem encontrados. Como a laringe está elevada, use uma tesoura de iridectomia curva para separar e cortar cuidadosamente o tecido esofágico da laringe. Em seguida, puxe a laringe para baixo e corte-a da cavidade bucal enquanto corta os anexos visíveis restantes. Observe a curvatura do estômago, que o distingue do esôfago e a restrição pilórica que marca o início do intestino. Corte o canal alimentar logo anterior à curvatura do estômago para separá-lo do esôfago. Abra a boca e localize a abertura compartilhada das trompas de Eustáquio em seu teto. Enquanto mantém a boca aberta, puxe o esôfago para observar sua fixação. Em seguida, corte o esôfago da cavidade bucal logo abaixo da abertura de Eustáquio. Em seguida, remova o esôfago. Agora segure o estômago e corte-o na restrição pilórica, onde ele se conecta ao duodeno. Puxe o cólon esticado e corte-o o mais próximo possível da cloaca. Remova os intestinos, cortando quaisquer anexos peritoneais visíveis ao longo do caminho. Se o sapo for macho, identifique os testículos e remova um usando uma tesoura de iridectomia, garantindo que o rim permaneça intacto. Separe os corpos gordurosos e posicione-os em seus respectivos lados para expor a inserção peritoneal perto do rim. Segure a base de um corpo gordo e corte-a do peritônio, deixando uma margem. Para remover a bexiga urinária, corte o mais próximo possível da cloaca. Se o sapo for fêmea ou tiver um oviduto vestigial visível, segure a extremidade inferior do oviduto e puxe-o para longe da cloaca. Corte o oviduto perto da cloaca e, em seguida, puxe-o para fora da cavidade celômica, cortando quaisquer anexos peritoneais. Usando uma pinça, segure os rins retroperitoneais emparelhados e corte o peritônio em sua base. Levante os rins para fora da cavidade, cortando todas as inserções peritoneais. Em seguida, segure o feixe de nervos no plexo ciático com uma pinça e corte os nervos onde eles saem da cavidade celômica. Levante o feixe de nervos e corte-o novamente em sua conexão com a coluna vertebral. Agora remova os pinos e vire o animal para o lado ventral. Fixe novamente os membros e selecione um membro posterior para amostragem, prendendo seu pé. Extirpar uma secção de pele em forma de amêndoa acima do gastrocnêmio e da região tíbio fibular. Segure a pele dorsal e faça uma incisão lateral ao redor da barriga do animal. Para criar um corte circular contínuo. Remova os pinos, prenda as pernas em uma mão e use uma pinça dentada de rato para segurar a pele dorsal anterior. Esfole o animal puxando com força a pele dorsal sobre a cabeça e os braços. Para amostrar o timo, identifique a massa gordurosa que cobre a articulação da mandíbula e corte a borda posterior da massa onde ela se funde com o tecido muscular rosa. Use uma tesoura de iridectomia para cortar a massa do osso, revelando aglomerados de melanóforos, se presentes. Em seguida, apare o tecido para eliminar qualquer músculo ou cartilagem. Em seguida, repine o animal e selecione um olho. Insira uma tesoura de iridectomia curva na órbita e corte suavemente ao redor da curvatura do olho para liberar os anexos musculares. Finalmente, deslize a tesoura mais fundo na órbita e corte o nervo óptico atrás do olho. Desaloje o olho de sua órbita e corte qualquer músculo restante. Seguindo este procedimento, todos os principais órgãos foram extraídos, enxaguados e aparados dentro de uma hora após a eutanásia.