Uma Técnica Simples de Microaspiração para Isolar Células Somáticas de Sêmen Equino Criopreservado como Doadores Nucleares para Clonagem
19 de dezembro de 2025
Este protocolo apresenta uma técnica simples de microaspiração para isolar células somáticas (SCs) viáveis a partir do sêmen criopreservado de equinos. Diferentemente das abordagens tradicionais, essa técnica evita cultivos in vitro prolongados e supera a contaminação por espermatozoides, permitindo o uso imediato na clonagem de células somáticas.
Nosso objetivo é mostrar que células somáticas do sêmen criopreservado de cavalos podem ser úteis para recuperar indivíduos de alto valor genético. Nosso desafio atual é conseguir selecionar células somáticas com DNA diploide intacto para serem usadas como doadoras nucleares. Para começar, remova os canudos de sêmen equino do tanque de nitrogênio líquido.
Exponha-os ao ar por 10 segundos e descongele-os em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 segundos. Pegue uma amostra de 250 microlitros do sêmen descongelado. Dilua com um mililitro de meio DMEM-F12 suplementado.
Incube a mistura de sêmen a 37 graus Celsius por 30 minutos. Pipete 25 microlitros da diluição incubada para um tubo e dilua em 975 microlitros de DPBS suplementados com 0,1 miligrama por mililitro de álcool polivinílico ou polivinil pirrolida. Misture suavemente a suspensão.
Mantenha a mistura de sêmen diluído a 37 graus Celsius durante todo o processo de coleta celular. Coloque uma tampa de placa de Petri contendo sêmen equino diluído no palco do microscópio para preparar a coleta de células somáticas. Selecione uma micropipeta de diâmetro adequado para coleta de células somáticas e conecte-a ao sistema mecânico de aspiração.
Insira cuidadosamente a micropipeta no micro drop e alinhe-a com a base da tampa do prato. Uma vez que a pipeta aspira o meio de cultivo, inicie a captura individual das células somáticas. Foque na parte inferior da microqueda, onde várias morfologias celulares são visíveis.
Posicione a ponta da micropipeta ao lado de cada célula somática e aspire sob pressão negativa. Colete células todas as redondas e alongadas, independentemente do tamanho. Após coletar 10 células, deposite-as em uma microgota de 10 microlitros localizada na superfície superior da tampa da panela.
Retenha todas as células somáticas coletadas dentro desse micro drop durante todo o processo de coleta. Uma vez coletado o número desejado de células somáticas, realize um procedimento simples de lavagem usando microgotas para remover espermatozoides, detritos e contaminantes microbianos. Usando uma segunda tampa de prato, realize uma lavagem sequencial de três etapas das células somáticas.
Use uma micropipeta para transferir as células somáticas para a primeira gota e deixe-as se acalmar por três a cinco minutos. Transfira as células da primeira gota para a segunda gota usando o mesmo procedimento. Repita a transferência mais uma vez e coloque as células somáticas na terceira gota.
Por fim, deposite as células somáticas isoladas em uma micro gota preparada designada para transferência nuclear de células somáticas. A técnica de microaspiração recuperou com sucesso células somáticas de sêmen equino criopreservado, com taxas de captura variando de 317,7 a 424,7 células por hora em três garanhões. Garanhão número 3 mostrando o maior rendimento.
Cinco tipos distintos de células somáticas foram identificados com base no tamanho e na morfologia. Identificamos uma população de células somáticas que difere em morfologia e viabilidade no sêmen equino criopreservado, que pode ser útil como doador nuclear. As células podem ser selecionadas com base em sua morfologia, e o procedimento não requer o estabelecimento de cultura primária.
Vamos focar em melhorar a viabilidade dessas células após o aumento do volume do sêmen equino.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta uma técnica de microaspiração para isolar células somáticas viáveis de sêmen equino criopreservado. Este método evita culturas in vitro prolongadas e contaminação por espermatozoides, permitindo o uso imediato em clonagem de células somáticas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia da Reprodução
Antecedentes
- Células somáticas podem ser derivadas de sêmen equino criopreservado.
- O isolamento de células somáticas viáveis é crucial para fins de clonagem.
- Os métodos tradicionais frequentemente envolvem tempos prolongados de cultivo.
- A contaminação por espermatozoides pode dificultar o processo de clonagem.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar uma técnica para isolar células somáticas do sêmen equino.
- Permitir o uso dessas células para clonar indivíduos de alto valor genético.
- Garantir que as células somáticas selecionadas possuam DNA diplóide intacto.
Métodos Utilizados
- Descongelamento de palhetas de sêmen equino a partir de nitrogênio líquido.
- Uso de banho-maria a 37 graus Celsius para descongelamento.
- Coleta de amostra e diluição do sêmen descongelado com meio DMEM-F12 suplementado.
- Aplicação de uma técnica de microaspiração para isolamento celular.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de células somáticas viáveis.
- Redução da contaminação por espermatozoides no processo.
- Utilização imediata das células isoladas para clonagem.
- Preservação da integridade do DNA diplóide nas células selecionadas.
Conclusões
- A técnica de microaspiração é eficaz para o isolamento de células somáticas.
- Este método aumenta o potencial para clonagem de células somáticas em equinos.
- Aplicações futuras poderiam levar à melhoria da recuperação genética na reprodução equina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A recuperação eficiente de células somáticas viáveis a partir de sêmen equino criopreservado resolve um gargalo crítico na utilização de recursos genéticos para tecnologias reprodutivas avançadas. Esta técnica de microaspiração permite acesso imediato a células doadoras diplóides para transferência nuclear de células somáticas (SCNT), evitando a necessidade de cultivo prolongado e reduzindo a contaminação por espermatozoides. A abordagem amplia o potencial de resgate genético e diversificação de portfólios em processos de biotecnologia animal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a análise direta da viabilidade de células somáticas e do status diplóide a partir de amostras criopreservadas.
- Apóia a validação funcional da adequação do doador nuclear para fluxos de trabalho de TCNS.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao permitir a seleção morfológica de células doadoras.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece um método rápido e reprodutível para o isolamento de células somáticas livres da interferência de espermatozoides.
- Fornece populações padronizadas de células para ensaios de clonagem em etapas subsequentes, sem a necessidade de estabelecimento de cultura primária.
- Permite a avaliação quantitativa do rendimento celular e da morfologia para otimização do processo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Aprimora a continuidade do armazenamento de recursos genéticos até aplicações pré-clínicas de clonagem.
- Alinha-se aos objetivos translacionais ao permitir a recuperação de genótipos de alto valor a partir de material arquivado.
- Reduz o risco biológico ao garantir a integridade das células doadoras antes da geração de embriões.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de microaspiração integra-se na interface da recuperação de recursos genéticos e do clonagem baseado em TCNS, conectando o armazenamento em criopreservação com o preparo imediato do doador nuclear.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre viabilidade celular e integridade genética de células doadoras a partir de fontes criopreservadas.
- Triagem: Padroniza o isolamento de células somáticas para entrada reprodutível na TCNC.
- Análises: Permite a medição quantitativa do rendimento celular e da diversidade morfológica.
- Pesquisa Translacional: Conecta sêmen biobancado a fluxos de trabalho de clonagem aplicáveis para resgate genético.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo reutilizável para diferentes origens genéticas e amostras arquivadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na adequação da célula doadora e reduz a ambiguidade mecanicista na TCND.
- Valor Operacional: Agiliza o isolamento celular, melhora a reprodutibilidade e elimina etapas demoradas de cultivo.
- Valor Estratégico: Permite decisões rápidas de prosseguir ou não em projetos de recuperação genética e otimiza a alocação de recursos.
- Impacto no Portfólio: Amplia o espectro de material genético viável para clonagem e estratégias de reprodução com ajuste de risco.
Considerações sobre a Implementação
- Exige expertise em micromanipulação e avaliação da morfologia celular.
- Requer acesso a sistemas de aspiração mecânica e infraestrutura de microscopia.
- Exige padronização entre equipes para procedimentos de seleção e lavagem celular.
- Adaptável a diversas amostras de sêmen, mas pode necessitar otimização para diferentes espécies ou condições de preservação.
- A viabilidade celular após o isolamento pode variar e deve ser monitorada quanto à prontidão para SCNT.
