Imagem de células vivas da permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose

Este protocolo descreve um método de imagem de células vivas para monitorar a permeabólização da membrana lisossômica durante a necroptose, utilizando sondas fluorescentes que detectam alterações na integridade e acidificação da membrana lisossômica. O desafio no campo é caracterizar a dinâmica dos organelos danificados durante o processo de morte celular e definir precisamente como esse dano deve impulsionar ou contribuir para a morte celular. Para começar, coloque 5.000 células em dois mililitros de meio DMEM suplementado com antibiótico em um recipiente de fundo de vidro estéril.

Coloque o recipiente em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e incube as células durante a noite. Adicione 20 microlitros de esferas verdes de dextrano a 25 microgramas por mililitro em meio DMEM fresco suplementado com antibiótico para diluir. Remova o meio antigo do prato e substitua por dois mililitros do meio suplementado de DMEM contendo carne bovina.

Coloque o recipiente em uma incubadora ajustado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e incube por 24 horas para permitir a internalização das contas nos lisossomos. Agora adicione dois microlitros de uma solução milimolar de estoque LysoTracker a dois mililitros de mídia DMEM fresca. Substitua o substrato antigo por essa solução de mancha.

Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas horas. Ligue os componentes do sistema confocal ligando o computador, microscópio, energia do scanner, potência do laser, emissão do laser e alimentação Leica. Ative os controles ambientais, incluindo o controlador de temperatura, chamado Cube, e o controlador do misturador de gás de dióxido de carbono, chamado Brick.

Abra o suprimento de dióxido de carbono e oxigênio. Ajuste o controlador de temperatura para 37 graus Celsius. Ajuste o controlador de gás e umidade para 5% dióxido de carbono e 95% de umidade.

Montem a câmara de imagem. Após a coloração, lave as células três vezes com dois mililitros de PBS e depois adicione dois mililitros de meio DMEM novo suplementado. Aplique óleo de imersão na lente objetiva antes da imagem.

Monte a antena no palco do microscópio. Ajuste a intensidade do laser até 3%, mas não mais que 5%. Depois, ajuste o ganho do detector no software do microscópio para otimizar o sinal. Minimize o fundo ajustando a barra de contraste.

Adquira imagens de referência das células não tratadas, que servem como condição de controle. Retorne a placa ao capuz de fluxo laminar e adicione um mililitro de antibiótico DMEM suplementado com indutores de morte celular. No software de aquisição, defina o modo para XYT, formate para 512 por 512, velocidade para 400, zoom para três, média de linha para um, acumulação de linha para três, acumulação de quadros para um, intervalo de tempo para três minutos, duração para oito horas e ative o foco automático.

Clique em iniciar para iniciar a aquisição em time-lapse. As imagens iniciais confirmaram a presença de pontos estáveis do LysoTracker e do dextran marcado com fluoresceína, indicando lisossomos intactos antes do tratamento. Quatro horas após o tratamento com TSZ, a fluorescência do LyoTracker foi visivelmente reduzida, enquanto o dextrano começou a apresentar distribuição citosólica difusa, indicando permeabilização inicial da membrana lisossômica.

Oito horas após o tratamento, o sinal do LysoTracker havia praticamente desaparecido, enquanto muitas células mantinham pontos de dextrano verde com sinal citosólico verde difuso. Demonstramos que a permeabolização da membrana lisossômica pode ser visualizada diretamente em uma célula viva passando por indução necroptótica. Esse protocolo demonstra que a combinação das esferas LysoTracker e dextrana permite monitoramento simultâneo do pH lisossomal e da liberação da carga em tempo real.

E importante para o avanço desse protocolo de imagem de células vivas é sua capacidade de monitorar pequenas mudanças de pH e permeabilização da membrana lisossômica em tempo real, capturando eventos dinâmicos que são ignorados pela análise de endpoints, como citometria de fluxo, e na coloração de monocamadas.