Testando a barreiras fisiológicas para a transmissão viral em Aphids Usando microinjeção
14 de maio de 2008
Pulgões são transmissores eficazes de vírus de plantas. Microinjeção pulgão do vírus, o procedimento que irá mostrar-lhe hoje, é uma técnica permitindo que os pesquisadores injetam vírus diretamente no hemocele do pulgão, contornando o intestino, uma das duas principais barreiras para a transmissão do vírus de uma maneira circulativo. A mesma técnica também é usada para injetar dsRNA para RNAi.
Se são transmissores eficazes de vírus de plantas, se é por microinjeção do vírus, o procedimento que vamos mostrar hoje é uma técnica que permite aos pesquisadores injetar o vírus diretamente na célula hemocítica do AFib, contornando o intestino, uma das duas barreiras principais para a transmissão do vírus de forma circulativa. Olá, sou Cecilia Tamrin Dehi, pós-doutoranda no departamento de patologia vegetal da Universidade Cornell. Hoje vou mostrar a vocês como injetar vírus nas células hemocíticas do AFI, vírus esse que pode então ser transmitido a diferentes espécies de plantas.
Por exemplo, esta planta de FE está infectada com o vírus do murchamento da batata (PLRV). É possível observar a diferença entre uma planta sadia e uma infectada. O sintoma mais notável é a esclerose taven.
O VPLR é um vírus luteiro que é transportado pelo APHIS em seu hemolinfa, o equivalente inseto ao sangue de mamíferos. Quando um AFI não infectado se alimenta de uma planta infectada, contrai o vírus através do suco da planta, que você pode ver aqui. Após a ingestão, o vírus deve passar do intestino do inseto para a hemolinfa e, em seguida, atravessar a glândula salivar para ser transmitido de volta à planta ESE.
E se for necessário muitos vírus durante a alimentação em uma planta ESE, no entanto, apenas uma fração maior passará pelo intestino e pela glândula salivar. As duas principais barreiras para a transmissão que infectam mais plantas a serem testadas. Se um AFI for inativado para vetar um vírus, alimentamos os AFIs com tecido infectado por dois dias, depois permitimos que se alimentem em uma planta sadia por cinco dias.
A planta é então fumigada e, após três semanas, começamos a buscar sintomas. Quando encontramos um AFib que não consegue transmitir um vírus, podemos avaliar qual das duas barreiras está impedindo a transmissão viral utilizando o procedimento de microinjeção, que vou mostrar a vocês hoje. Neste procedimento, o vírus é injetado diretamente na hemocele, contornando diretamente a barreira de transmissão intestinal.
Então, vamos começar e eu vou mostrar como microinjetar alguns ápices. Este é o vidro, as agulhas de vidro que utilizamos. Nós puxamos as agulhas de vidro a partir dessas hastes de vidro usando o APU apu.
Então, este é o microinjetor. Para realizar a microinjeção de um vírus. Vou começar a inserir a agulha no suporte da agulha.
Então, estou apenas colocando a agulha e posicionando-a. Agora vou carregar o vírus na agulha até o topo deste reservatório. Agora precisamos posicionar o AFI para microinjeção.
Então, vou pegar um AFI com a pressão da dor e vou colocá-lo no suporte do AFI. Idealmente, tentarei posicionar a parte traseira do afídeo contra o suporte para ter acesso à parte abdominal do AFib. Ok, ótimo.
Agora podemos prosseguir com a microinjeção. Ok, agora vou posicionar a agulha e aproximá-la do AFib. Então, agora vou trazer a agulha em contato com o AFib e perfurar o exoesqueleto; o ideal é tentar perfurar entre os segmentos na base das pernas.
Então, vou fazer a injeção. Agora estou retirando o AFI com o pincel e colocando no papel de recuperação, onde vou deixá-lo repousar por um momento. Portanto, também precisamos microinjetar o AFI controle.
Esta microinjeção de controle é realizada apenas com o tampão, sem o vírus. O tampão que utilizamos é tampão fosfato 0,1 M, pH 7. Assim, vou aplicar o afi em uma planta sadia, onde vou mantê-lo por cinco dias; após esse período, vou infectar a planta e aguardar o desenvolvimento de sintomas após a microinjeção do ácido nucleico de fita simples durante uma semana. A cada dia, o nível de expressão do gene alvo é medido no afi.
Então, acabamos de microinjetar um AFI que era incapaz de transmitir o vírus. Se, após a microinjeção, o AFI for capaz de transmitir o vírus, isso significará que esse AFI possui uma barreira intestinal que estava bloqueando o vírus. Se, por outro lado, não houver desenvolvimento de sintomas, significará que esse AFI possui uma barreira forte nas glândulas salivares.
Portanto, acabamos de mostrar como microinjetar vírus nos afídeos. Esse mesmo procedimento é utilizado para microinjetar RNA de fita simples nos afídeos e realizar interferência por RNAi, uma técnica interessante para auxiliar no estudo da função gênica em afídeos. Assim, conclui-se a microinjeção.
Espero que goste e que seja útil para os seus experimentos. Obrigado.
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Visão Geral
Os afídeos atuam como transmissores eficazes de vírus de plantas. Este artigo demonstra uma técnica de microinjeção que permite aos pesquisadores injetar vírus diretamente no hemocélio de afídeos, contornando o intestino, que é uma barreira significativa para a transmissão de vírus.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Fitopatologia
- Viologia
- Entomologia
Contexto
- Os afídeos são vetores conhecidos de diversos vírus de plantas.
- Compreender os mecanismos de transmissão de vírus é essencial para a saúde das plantas.
- Técnicas de microinjeção podem aprimorar a pesquisa sobre interações entre vírus e hospedeiros.
- A injeção direta no hemocélio evita barreiras digestivas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a técnica de microinjeção para introdução de vírus em afídeos.
- Facilitar o estudo da transmissão de vírus para plantas.
- Fornecer informações sobre os efeitos de vírus específicos na saúde das plantas.
Métodos Utilizados
- Microinjeção de vírus no hemocelo de afídeos.
- Observação da transmissão do vírus para plantas hospedeiras.
- Comparação entre plantas infectadas e saudáveis.
- Documentação dos sintomas associados a infecções virais.
Resultados Principais
- Conseguiu-se a injeção bem-sucedida de vírus em afídeos.
- As plantas infectadas exibiram sintomas notáveis, como esclerose taven.
- A técnica permite o estudo direto dos efeitos dos vírus sobre as plantas.
- Demonstrou-se o potencial dos afídeos em transmitir vírus de forma eficaz.
Conclusões
- A técnica de microinjeção é uma ferramenta valiosa para o estudo de vírus de plantas.
- Os afídeos podem ser utilizados para modelar a dinâmica de transmissão de vírus.
- Pesquisas futuras podem explorar as implicações para a saúde e o manejo de culturas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissecação de barreiras fisiológicas à transmissão viral em afídeos por meio de microinjeção permite a validação precisa de alvos relacionados à capacidade vetorial em modelos agrícolas de patógenos. Essa abordagem esclarece os gargalos mecanicistas na passagem do vírus, reforçando a confiança preditiva em pesquisas translacionais de patologia vegetal e biologia de vetores. O método orienta decisões ajustadas ao risco em estratégias de pipeline voltadas à mitigação de doenças transmitidas por vetores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta das barreiras do intestino e das glândulas salivares em estudos de competência vetorial.
- Apóia a redução de riscos mecanicistas ao isolar pontos de controle fisiológicos na transmissão de vírus.
- Facilita a validação funcional de alvos candidatos que afetam a passagem de patógenos em vetores insetos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos de insetos validados para triagem subsequente de intervenções bloqueadoras da transmissão viral.
- Padroniza a microinjeção como um ensaio reprodutível para análise da função de barreira.
- Gera resultados quantitativos sobre o sucesso da transmissão após a superação da barreira.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos de competência vetorial com cenários de transmissão relevantes para doenças em pipelines de proteção de cultivos.
- Permite a continuidade do descobrimento mecanicista até a validação pré-clínica de estratégias direcionadas a vetores.
- Apoia a redução preditiva de riscos para pesquisas translacionais em epidemiologia de vírus em plantas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de microinjeção integra-se na interface entre a descoberta inicial e a validação pré-clínica em fluxos de trabalho de biologia de vetores e patologia de plantas.
- Biologia da Descoberta: Esclarece pontos de controle fisiológicos na competência vetorial, apoiando a validação direcionada de alvos baseada em hipóteses.
- Triagem: Fornece um ensaio padronizado para avaliar a função de barreira e a eficácia de intervenções.
- Análises: Fornece leituras quantitativas sobre a transmissão viral após microinjeção para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a modelos pré-clínicos de transmissão de doenças vetoriais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para dissecar barreiras de transmissão em diferentes sistemas vetor-patógeno.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na competência vetorial e em estratégias de bloqueio da transmissão.
- Valor Operacional: Padroniza ensaios de ultrapassagem de barreira para garantir reprodutibilidade e escalabilidade nos fluxos de pesquisa e desenvolvimento.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou interromper intervenções direcionadas a vetores e a alocação de recursos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos vetor-patógeno para avanço translacional.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência técnica em microinjeção e manipulação de insetos.
- Necessita de instrumentação especializada para microinjeção e sistemas de tampão validados.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade do ensaio e comparabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes espécies de afídeos ou combinações vetor-patógeno.
- Limitado à análise de barreiras fisiológicas; não aborda variáveis ecológicas ou em nível de campo.
