Um Fluxo de Trabalho Prático para a Análise de Dados de Transcriptômica Espacial: da Aquisição de Dados às Análises Avançadas

Olá a todos. Neste vídeo, vamos percorrer um pipeline prático de análise de dados de transcriptômica espacial, desde a aquisição e carregamento dos dados até a exploração básica e, por fim, a análise avançada. No geral, o fluxo de trabalho consiste em três etapas principais.

Primeiro, baixar os dados; segundo, obter o código de análise; e terceiro, executar o pipeline para gerar os resultados. Etapa um: aquisição de dados e preparação da estrutura de diretórios. Primeiro, obtenha conjuntos de dados públicos de transcriptômica espacial.

Baixe o arquivo de dados brutos. E extraia o arquivo. Organize os arquivos em uma estrutura de diretórios padronizada.

Primeiro, crie um diretório principal de dados e, em seguida, crie um subdiretório dedicado para cada amostra. Transfira os seguintes arquivos essenciais de cada amostra para o subdiretório respectivo. Depois, crie uma subpasta espacial dentro de cada diretório de amostra.

Coloque os seguintes arquivos na subpasta espacial. Coloque o arquivo S1 de métricas de PC de características filtradas na subpasta principal da amostra. Descompacte os arquivos gzip na pasta espacial.

Garanta que os nomes originais dos arquivos permaneçam exatamente como exigido pela função de carregamento espacial 10X. Segundo passo: configuração do ambiente de software. Aqui, pulamos a instalação da linguagem R e o processo de análise começa com a obtenção do script de análise no repositório do GitHub.

Instale os pacotes R necessários do Graham no arquivo do condutor executando o script setup R. Instale o auto suit executando os comandos de instalação fornecidos na planilha do documento oficial. Acesse a URL oficial de instalação para recuperar os scripts de configuração. Inicialize o ambiente Python necessário e as dependências do sistema de acordo com as instruções da página de configuração.

Obtenha a ferramenta personalizada acessando o repositório do GitHub e baixe o código-fonte. Navegue até o diretório TOS e instale as dependências do Python. Passo três: carregamento dos dados espaciais e controle de qualidade.

Leia os dados espaciais no objeto Seurat. Use ler imagem 10X para carregar manualmente a imagem de tecido de alta resolução. Especifique a imagem e o nome da imagem.

Utilize a opção carregar 10X espacial com a imagem definida como o objeto de imagem criado na etapa anterior e crie o objeto Seurat. Calcule as métricas de controle de qualidade. Compute a porcentagem de leituras mitocondriais utilizando o conjunto de características percentuais com o padrão mt.

Visualize e interprete os dados com base nas métricas de controle de qualidade (QC). Gere gráficos de violino de nCount_Spatial, nFeature_Spatial e percent. mt utilizando a função de gráfico de violino.

Crie gráficos de características espaciais dessas métricas utilizando gráficos de características espaciais. E identifique pontos fora da área do tecido. Opcional: aplique filtros para remover pontos de baixa qualidade.

Após executar o script, você pode obter esses resultados, incluindo métricas de controle de qualidade (QC) e o gráfico espacial de características. Passo quatro, pré-processamento dos dados, integração e agrupamento. Normalizar no pré-processamento de amostras individuais.

Aplicar, separadamente para cada amostra, a normalização SC transform com o ensaio Spatial. Integrar múltiplas amostras. Preparar a lista de objetos normalizados por SCTransform para integração.

Certifique-se de que cada objeto tenha um ensaio de RNA copiando o ensaio espacial. Utilize as características de integração selecionadas na integração PREP SCT para identificar características variáveis compartilhadas. Encontre os âncoras de integração utilizando encontrar âncoras de integração com o método de normalização SCT.

Integre os dados utilizando IntegrateData. Realize a redução de dimensionalidade na agrupamento no ensaio integrado. Execute PCA nos dados integrados utilizando runPCA.

Determine o número ideal de componentes principais para a análise subsequente calculando a variância acumulada explicada. Identifique o ponto de cotovelo por meio de programa adequado. Execute o UMap utilizando o número determinado de PC.

Agrupe as células utilizando FindNeighbors e FindClusters. Especifique os PCs determinados na resolução definida em 0,5. Realize análise de expressão diferencial entre os grupos-alvo utilizando a função FindWorkers.

Identifique genes com variabilidade espacial. Para cada amostra original, execute a busca de características espacialmente variáveis utilizando o método de Moran's I no ensaio SCT para calcular a autocorreção espacial. Após executar este script, você poderá obter o gráfico de cotovelo, o gráfico UMap, o gráfico de agrupamento, o mapa de calor dos marcadores de agrupamento, o gráfico de volcão, os genes diferencialmente expressos por característica espacial, os genes espacialmente confiáveis e os marcadores das camadas do cólon.

E o gráfico de pontos dos marcadores da camada do cólon, juntamente com os marcadores no gráfico de características espaciais. Passo cinco, pré-processamento dos dados de referência de única célula. Leia a matriz de contagem de RNA-seq de única célula utilizando read 10X e crie um objeto Seurat.

Realize a normalização de QC padrão e desagrupamento. Calcule a porcentagem de leituras mitocondriais nas células filtradas. Normalize os dados utilizando a transformação SC.

Defina uma vara.to. Regresse o percent.mt. Execute a PCA e o UMap longos e agrupe as células utilizando o método dinâmico de seleção de PCs descrito nos passos anteriores, depois anote os tipos celulares.

Calcule os escores dos módulos para genes marcadores de tipos celulares canônicos utilizando o AddModuleScore. Anote os agrupamentos com base nos escores dos módulos e na biologia conhecida. Alternativamente, importe anotações pré-computadas dos metadados.

Após aprender este script, você poderá obter as métricas de controle de qualidade. Eles já enviaram o UMap por agrupamento, UMap por amostra e os escores de tipos celulares. Etapa seis, desconvolução guiada por referência com o SPOTlight.

Primeiro, prepare os dados para o SPOTlight. Converta o objeto Seurat de célula única anotado e o objeto Seurat espacial em um objeto de experimento de célula única. Normalize os dados de célula única por log utilizando LogMoreCounts.

Em seguida, execute a desconvolução SPOTlight. Primeiro, identifique genes altamente variáveis nos dados de célula única utilizando o ModelGeneVar. Calcule os marcadores de tipo celular usando a pontuação de marcadores e filtre os marcadores de alta qualidade.

Reduza a amostragem da referência de célula única para cada tipo celular a um número gerenciável para diminuir o tempo computacional. Execute a desconvolução utilizando a função SPOTlight, fornecendo a referência de célula única, os dados espaciais, a lista de marcadores e os HVGs; em seguida, podemos visualizar e exportar os resultados. Você pode obter o resultado da desconvolução assim, mostrado como um gráfico de dispersão.

Etapa sete, desconvolução não supervisionada com Stdeconvolve. Primeiro, prepare os dados espaciais. Extraia as métricas de contagem de linhas do objeto espacial Seurat utilizando GetAssayData com o slot counts.

Remova pontos e genes de baixa qualidade utilizando contagens limpas do STdeconvolve. Identifique os tipos celulares latentes para os filtros que o corpus quatro genes expressos em uma fração mínima de pontos usando LDA restrito estrito por meio desse modelo de alocação em uma variedade de números potenciais de tópicos usando fitLDA. Selecione o modelo ótimo com base na complexidade mínima usando o modelo ótimo com opt min.

Analise e visualize os resultados. Extraia a proporção de sorotipos, Theta, e os perfis gênicos Beta para o modelo ótimo utilizando getBetaTheta. Para incluir a interpretação biológica dos tópicos de corrosão, importe anotações de regiões de interesse geradas pela ferramenta de seleção de pontos espaciais.

Use essas anotações como parâmetro do grupo na função com todos os tópicos. Ao seu projeto, recoloque as proporções de tipos celulares desconvoluídas nas coordenadas espaciais e codifique por cores os pontos conforme sua ROI. Após executar o script, você obterá um resultado como este, uma carga de tubo de escala, como aquelas produzidas pelo SPOTlight.

Passo oito, comunicação espacial célula-célula usando o Giotto. Primeiro, converta o objeto Seurat em um objeto Giotto. Utilize a função createGiottoObject, fornecendo as métricas de contagem baixa e as coordenadas espaciais.

Pré-processe o objeto Giotto e adicione o resultado da desconvolução. Normalize os dados utilizando o Giotto normalizado, adicionando como anotações de sorotipo. Escolha as metainformações das células utilizando addCellmetadata.

Crie uma rede espacial utilizando o createSpatialNetwork. Carregue uma base de dados de receptores e ligantes em nosso ambiente. Execute o explore CellCellcom para identificar interações significativas entre ligantes e receptores entre tipos celulares que estão em proximidade espacial.

Você pode obter o gráfico de pontos de comunicação célula-célula assim. O passo nove é opcional. Seleção interativa de pontos com SelectSpatialSpot.

Prepare os dados para a ferramenta interativa usando o script six. Extraia as coordenadas espaciais do objeto Seurat usando GetTissueCoordinates. Formate e exporte os dados.

Exporte o quadro de dados formativo para um arquivo CSV. Em seguida, realize a análise da região de interesse. Inicie o personalizado.

Selecione as aplicações de pontos espaciais e carregue o arquivo CSV. Selecione interativamente os pontos com base na localização espacial. Em seguida, exporte a lista dos pontos selecionados e seus grupos atribuídos, rotulados como um novo arquivo CSV.

Acabamos de verificar o que podemos obter após executar o script passo a passo. Todos os resultados são salvos na pasta de resultados dividida em cinco partes. E, como você pode ver, podemos obter as métricas de QC e dividir.

E você pode verificar o gráfico de características espaciais aqui. Além disso, o processo de desconvolução é realizado de forma supervisionada e não supervisionada. Os resultados do SPOTlight estão aqui.

Como você pode ver, todos os pontos contêm as informações de proporção. Os resultados da desconvolução não supervisionada pelo STdeconvolve também são gerados aqui. E este é o resultado dos agrupamentos do Seurat para o ponto nos dados espaciais.

Você também pode visualizá-los no gráfico espacial da equipe, como este. Além disso, você também pode obter o resultado da comunicação entre spots usando o Giotto. Todo este fluxo de trabalho é 100% de código aberto.

Análise de pontos desde as métricas de expressão até a modelagem espacial avançada. Todos os passos são executados em uma máquina com 16 GB de RAM. A base de código é modular, um script para cada tarefa.

Observe que este fluxo de trabalho não abrange o processamento inicial a partir do preço FASTQ. O foco está nos dados espaciais 2D e atualmente inclui apenas os programas de download do Visium. É isso; obrigado por assistir.