Protocolo para Dissociação de Célula Única, Sequenciamento de RNA e Isolamento de Células Mioepiteliais e Fibroblastos das Glândulas Lagrimais e Salivares Envelhecidas
24 de abril de 2026
Este protocolo descreve um método otimizado para dissociar glândulas lacrimais de camundongos envelhecidos para obter células individuais viáveis para sequenciamento de RNA unicelular. Digestão enzimática sequencial e manuseio suave preservam a integridade celular, resultando em suspensões de alta qualidade adequadas para isolamento específico por tipo celular e análise transcriptômica de alterações associadas ao envelhecimento nas populações de glândulas lacrimais.
Meu laboratório estuda como as mudanças relacionadas à idade nas glândulas salivares e lacrimais afetam diferentes tipos celulares usando citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular. Métodos padrão de dissociação recuperam mal células epiteliais frágeis de glândulas salivares e lacrimais envelhecidas. E meu protocolo melhora a viabilidade das células e permite uma análise e separação de células únicas confiáveis.
Para começar, posicione o camundongo eutanasiado em deitado na mesa de dissecação. Usando pinças finas e tesouras, incida a pele entre o olho e a orelha. Retraa suavemente a pele para expor a glândula lacrimal.
Usando pinças de ponta cega, levante levemente a glândula lacrimal. Separe cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor, provocando-o suavemente em um movimento circular. Identifique os limites visíveis da glândula lacrimal e separe-a dos tecidos adjacentes, incluindo a glândula parótida.
Depois, transfira a glândula lacrimal para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de PBS frio sobre gelo. Sob um microscópio dissecador, remova a gordura restante e cuidadosamente remova a cápsula de tecido conjuntivo da glândula lacrimal. Coloque uma placa de Petri estéril de 35 milímetros sobre gelo.
Adicione de 800 a 1000 microlitros de PBS frio ao centro do recipiente e transfira uma glândula lacrimal para o PBS. Certifique-se de que o tecido permaneça submerso em PBS. Usando dois bisturis estéreis, triture finamente a glândula lacrimal em pequenos fragmentos até que ela atinja uma consistência macia e pastosa.
Recolha os fragmentos de tecido em um dos lados do prato. Aspire o PBS residual e lave os fragmentos com um mililitro de PBS fresco e frio. Transfira os fragmentos de tecido lavados para uma placa de 12 poços contendo dois mililitros por poço de meio de digestão pré-aquecido.
Coloque o prato em um banho-maria agitante e incube a 37 graus Celsius e 60 rotações por minuto durante 30 minutos. Usando uma ponta de pipeta de um mililitro de grande calibre, triture suavemente o tecido 15 vezes. Volte a placa ao banho-maria agitada e incube por mais 30 minutos.
Em seguida, usando uma ponta comum de um mililitro de pipeta, triture suavemente a amostra 10 vezes e incube novamente por 30 minutos. Depois, triture suavemente a amostra 10 vezes e transfira a suspensão da célula para tubos microcentrífugas dolphin de dois mililitros. Adicione um mililitro de meio bloqueador a frio um, ou BM1, a cada poço da placa para coletar o meio digestivo restante contendo células residuais e coloque a placa no gelo até a próxima etapa.
Centrifuge os tubos que contêm a suspensão da célula a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante de cada tubo. Transfira o BM1 de cada poço da placa contendo células residuais para o tubo correspondente.
Em seguida, adicione 600 microlitros de BM1 frio em cada poço para enxaguar as células restantes e transfira a lavagem para o tubo correspondente para combinar com a suspensão da célula. Suspenda suavemente a suspensão da célula. Centrifuge os tubos novamente a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.
Adicione um mililitro de Accutase aos pellets celulares e ressuspenda suavemente as células. Incube o tubo a 37 graus Celsius e 60 rotações por minuto por cinco a dez minutos. Usando uma ponta de pipeta de um mililitro, triture suavemente a amostra 10 vezes.
Depois, adicione um mililitro de BM2 frio ao tubo para terminar a reação enzimática diluindo a Accutase. Centrifuge o tubo a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Adicione meio contendo DNase 1 em concentração de 200 unidades por mililitro ao tubo para ressuspender as células e encher o tubo até o topo.
Incube o tubo por 10 minutos em temperatura ambiente e suspenda suavemente uma vez após cinco minutos. Enquanto isso, coloque um filtro de célula de 70 micrômetros sobre um tubo cônico de 15 mililitros e pré-umeça o escorredor com um mililitro de BM3. Após a incubação, transfira a suspensão celular para o peneirador.
Adicione um mililitro de BM3 no tubo original de coleta para enxaguar e transfira o enxágue para a mesma peneira. Lave o peneiro com mais cinco mililitros de BM3. Por fim, determine a concentração celular e a viabilidade da suspensão celular filtrada usando coloração azul de tripano e um contador celular automatizado.
Prossiga com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única para perfil de expressão gênica, ou triagem celular baseada em citometria de fluxo de populações celulares marcadas fluorescente. A análise UMAP dos dados de sequenciamento de RNA unicelular identificou populações epiteliais e estromais bem representadas na glândula lacrimal, incluindo células mioepiteliais e fibroblastos, bem como diversas populações de células imunes. Glândulas lacrimais envelhecidas continham plasma abundante e células B ativadas expressando IGHM e IGHD.
A citometria de fluxo sequencial permitiu a separação clara de células mioepiteliais positivas para EpCAM e GFP das células mural negativas para EpCAM e positivas para GFP. Fibroblastos GFP-positivos que expressam PDGFR alfa eram EpCAM negativos, permitindo a discriminação das células epiteliais. Em camundongos PDGFR alfa e EGFP, todas as células positivas para GFP também expressaram colágeno um, confirmando a identidade dos fibroblastos.
A análise de citometria de fluxo mostrou que 99,6% das células positivas para GFP correspondiam a células imuno-coloridas por PDGFR alfa. Esse protocolo foi desenvolvido para isolar células individuais viáveis de glândulas lacrimais para caracterização molecular de populações epiteliais, estromais e imunes. O principal desafio é minimizar o estresse mecânico e enzimático durante a dissociação de tecidos frágeis envelhecidos, ao mesmo tempo em que se mantém alta viabilidade celular para o sequenciamento de RNA unicelular.
Seguindo esse procedimento, células isoladas podem ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única, sequenciamento de RNA em massa e perfilamento molecular de populações celulares específicas. Células ordenadas também podem ser cultivadas para ensaios funcionais posteriores.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo otimizado para o isolamento de células únicas viáveis de glândulas lacrimais (GLs) de camundongos idosos, permitindo sequenciamento de RNA de célula única de alta qualidade (scRNA-seq) e análise por citometria de fluxo. O método aborda os desafios impostos pelo aumento da fibrose, fragilidade celular e acúmulo de lipídios nas GLs envelhecidas, garantindo dissociação eficiente e recuperação de diversos tipos celulares para perfis moleculares posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular e molecular
- Oftalmologia e pesquisa em glândulas exócrinas
- Transcriptômica de célula única
Antecedentes
- O envelhecimento da glândula lacrimal leva à redução da secreção lacrimal e à inflamação crônica, contribuindo para a doença do olho seco.
- As alterações relacionadas à idade incluem infiltração de células imunes, danos celulares, acúmulo de lipídios, deposição da matriz extracelular e dilatação ductal.
- A sequenciação de RNA de única célula é uma ferramenta poderosa para caracterizar a heterogeneidade celular e as alterações transcricionais durante o envelhecimento.
- A obtenção de suspensões viáveis de única célula a partir de glândulas lacrimais envelhecidas é tecnicamente desafiadora devido à fragilidade tecidual e à fibrose.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo reprodutível para a dissociação eficiente de glândulas lacrimais de camundongos idosos.
- Permitir o isolamento de múltiplos tipos celulares adequados para scRNA-seq e citometria de fluxo.
- Minimizar danos celulares e maximizar a viabilidade durante o processamento do tecido.
Métodos Utilizados
- Dissecação cuidadosa e picagem do tecido da glândula lacrimal de camundongos eutanasiados.
- Digestão enzimática em etapas utilizando Colagenase IV, Dispase II, DNase I e Accutase.
- Uso de placa pré-revestida e controle de temperatura/agitação para reduzir o estresse celular.
- Lise de hemácias e filtração sequencial através de filtros para aumentar a pureza celular.
- Isolamento específico por tipo celular utilizando linhagens de camundongos repórter (Acta2GFP e PdgfraEGFP) e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) após imunomarcação com anticorpo EpCAM.
Resultados Principais
- O protocolo produz suspensões de células únicas viáveis e de alta qualidade a partir de glândulas lacrimais jovens e envelhecidas.
- A análise UMAP dos dados de scRNA-seq identificou populações bem representadas de células epiteliais, estromais e imunes diversas.
- A citometria de fluxo permitiu a separação e identificação claras de células mioepiteliais (EpCAM+, GFP+) e fibroblastos (PDGFRα+, EpCAM-).
- Em glândulas lacrimais envelhecidas, detectaram-se abundantes plasmócitos e linfócitos B ativados que expressam IGHM e IGHD.
- 99,6% das células positivas para GFP corresponderam a fibroblastos marcados por imuno-histoquímica para PDGFRα, confirmando a identidade celular.
Conclusões
- Este protocolo permite a dissociação eficiente e suave de glândulas lacrimais envelhecidas para análise em nível de única célula.
- Ele garante alta viabilidade celular e recuperação de múltiplos tipos celulares, incluindo populações epiteliais e estromais frágeis.
- O método é adaptável a outros tecidos exócrinos fibroticos ou envelhecidos que requeiram isolamento celular direcionado.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissociação e isolamento eficientes de células individuais de glândulas lacrimais e salivares envelhecidas resolvem um gargalo crítico na caracterização da heterogeneidade celular e das alterações transcricionais associadas ao envelhecimento tecidual e à fibrose. Este protocolo permite a recuperação com alta viabilidade de populações epiteliais e estromais frágeis, apoiando sequenciamento robusto de RNA em nível de célula única e triagem celular direcionada para pesquisas em fase de descoberta. O método aumenta a confiança preditiva na caracterização molecular específica por tipo celular, contribuindo para a validação precoce de alvos e redução de riscos mecanicistas em modelos de doenças de glândulas exócrinas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de alterações celulares e moleculares relacionadas à idade em tecidos exócrinos.
- Apóia a validação funcional de alvos ao isolar células mioepiteliais e fibroblastos viáveis para análises posteriores.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao fornecer suspensões de células únicas de alta qualidade para perfis transcriptômicos.
- Melhora a confiança preditiva na modelagem de sistemas relevantes para doenças como o olho seco e distúrbios relacionados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara suspensões únicas de células validadas, adequadas para protocolos de scRNA-seq e citometria de fluxo de alto rendimento.
- Padroniza etapas de dissociação e isolamento para maximizar a reprodutibilidade e a qualidade da saída quantitativa.
- Permite o ordenamento confiável de tipos celulares específicos utilizando FACS e linhagens de camundongos repórter para o desenvolvimento de ensaios.
- Permite adaptação escalonável a outros tecidos exócrinos fibroticos ou envelhecidos com desafios semelhantes de dissociação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados de perfis moleculares com biomarcadores relevantes para doenças em modelos de tecidos envelhecidos.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo ensaios funcionais em populações celulares classificadas.
- Reduz o risco biológico em estudos translacionais ao assegurar alta viabilidade e pureza celulares para aplicações posteriores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir análise robusta em nível de célula única e isolamento direcionado de células a partir de tecidos envelhecidos difíceis.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias na disfunção das glândulas exócrinas relacionada à idade.
- Triagem: Gera suspensões simples de células reprodutíveis e de alta pureza para ensaios transcriptômicos e citométricos quantitativos.
- Análises: Fornece dados moleculares resolvidos por tipo celular e permite comparação estatística de populações celulares entre grupos etários.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores e a validação funcional em modelos de tecidos envelhecidos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Protocolo adaptável para diversos tecidos exócrinos, apoiando a escalabilidade da plataforma e a padronização entre programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em análises específicas de tipo celular.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de fluxos de trabalho de célula única em tecidos envelhecidos e fibroticos.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir um perfil molecular robusto em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas voltados à disfunção das glândulas exócrinas e ao envelhecimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, dissociação enzimática e separação celular baseada em citometria de fluxo.
- Exige acesso a contadores automatizados de células, instrumentação de FACS e plataformas de sequenciamento de RNA de célula única.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de dissociação e separação para garantir reprodutibilidade.
- A adaptação a outros tecidos pode exigir otimização das concentrações de enzimas e dos tempos de incubação.
- A viabilidade e o rendimento celular podem ser limitados pela fibrose tecidual e pela fragilidade celular em modelos avançados de envelhecimento.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
0:36
Lacrimal Gland Tissue Isolation from PdgfraEGFP Transgenic Mouse
1:38
Fragmentation of Harvested Lacrimal Gland Tissue
2:27
Enzymatic Digestion of the Tissue Fragments and Primary Washes
4:30
Accutase and DNase I Treatment
6:33
Results
7:58
Conclusion
