Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Nosso laboratório estuda o papel das células natural killer na saúde e na doença, com o objetivo de aproveitar seu potencial para melhorar tratamentos contra cânceres sólidos e sanguíneos. Os ensaios existentes de citotoxicidade de células NK carecem de padronização entre plataformas e configurações. Este protocolo fornece métodos reprodutíveis de imagem de células vivas e citometria de fluxo para avaliação precisa da citotoxicidade.

Para começar, prepare 10 mililitros de SYTOX Orange 2x diluindo a solução estoque de SYTOX Orange em meio de cultura NK-92 em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Conte as células-alvo utilizando um contador Luna após a mistura com Azul de Tripano ou use qualquer método validado de contagem celular baseado na exclusão de corante. Transfira a quantidade necessária de células-alvo para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros.

Centrifugue o tubo a 300G durante cinco minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Em seguida, re-suspenda as células-alvo até uma concentração final de 250.000 células por mililitro em meio 2X SYTOX Orange. Para preparar a célula efetora, avalie a viabilidade e a concentração das células NK-92 e prossiga apenas se a viabilidade for superior a 80%, pois viabilidades mais baixas podem afetar o desempenho do ensaio.

Conte e transfira o número necessário de células NK-92 para tubos cónicos individuais de 15 mililitros. Após a centrifugação, re-suspenda as células até uma concentração final de 500.000 células por mililitro. Prepare diluições das células efetoras adicionando 240 microlitros de células efetoras em poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços para a proporção de duas para uma de efetoras para alvo, e adicione 120 microlitros de meio nos poços restantes.

Realize diluições seriadas em duplicidade de dois para um até 0,25 para um nas proporções de efetores para alvos, misturando completamente por pipetagem pelo menos cinco vezes e trocando as ponteiras entre as transferências. Em seguida, para montar a co-cultura, obtenha a placa de 96 poços com fundo plano revestida com polilisina. Imediatamente antes da transferência, re-suspenda completamente as células alvo e efetoras sem criar bolhas, e então adicione 100 microlitros de cada suspensão celular nos poços apropriados.

Em seguida, adicione 200 microlitros de PBS aos poços não utilizados ao redor. Centrifugue a placa a 100G durante dois minutos à temperatura ambiente. Coloque a placa no sistema de imagem de células vivas.

Adquira imagens a cada uma hora durante 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Verifique a qualidade das imagens após a primeira varredura e ajuste as configurações de aquisição, se necessário. Ajuste a separação espectral para corrigir a sobreposição do SYTOX Orange no canal verde.

Verifique se as células mortas positivas de cor laranja não estão sendo identificadas incorretamente como células positivas verdes. Para configurar a análise individual de células não aderentes, defina o diâmetro esperado do objeto como 15 micrômetros, compatível com o diâmetro celular aproximado. Defina a sensibilidade de limiar e a sensibilidade de textura como cinco e a sensibilidade de borda como 10 para facilitar a separação de agregados celulares.

Defina o intervalo do filtro de área do objeto aceito entre 50 e 2.000 micrômetros quadrados para excluir detritos e objetos grandes. Defina o valor máximo de excentricidade como 0,95 para excluir objetos não celulares. Obtenha células NK humanas primárias cultivadas por 16 a 24 horas.

Transfira 500.000 células-alvo para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS. Centrifugue as células a 300G durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova o sobrenadante. Prepare uma solução trabalho de 0,5 micromolar de éster succinimidila de carboxifluoresceína ou CFSC em PBS, diluindo um microlitro de solução estoque de CFSE de cinco milimolar em 10 mililitros de PBS. Re-suspenda o pellet obtido em aproximadamente um milhão de células por mililitro na solução de CFSE.

Incube as células por 15 minutos a 37 graus Celsius, envolvidas em folha de alumínio para proteger da luz. Em seguida, interrompa a reação adicionando cinco a dez volumes de meio de cultura e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a centrifugação das células, re-suspenda o pellet celular a 250.000 células por mililitro, de modo que 100 microlitros contenham 25.000 células.

Adicione 100 microlitros por poço de células-alvo aos poços designados de uma placa de 96 poços com fundo redondo utilizando uma pipeta multicanal. Plaque cada condição em triplicata. Em seguida, prepare 200 microlitros de solução de anticorpo 4X em meio de cultura de células NK para cada anticorpo em teste e seu controle de isotipo correspondente.

Transfira as soluções de anticorpo para uma placa de poços profundos. Adicione 50 microlitros de solução de anticorpo a cada poço contendo as células-alvo e misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos cinco vezes. Adicione 50 microlitros de meio de cultura de células NK por poço aos poços de controle sem anticorpo e misture bem pipetando.

Incube a placa por 25 a 30 minutos em condições padrão de incubação. Conte e obtenha 200.000 células NK e prossiga apenas se a viabilidade for maior ou igual a 75%. Re-suspenda as células em 250.000 células por mililitro em 800 microlitros de meio de cultura de células NK humanas primárias. Adicione 50 microlitros por poço de células NK aos poços correspondentes e misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos cinco vezes.

Em seguida, pipete 50 microlitros por poço de meio de cultura nos poços controle e misture completamente. Inspecione cuidadosamente a placa de fundo redondo de 96 poços para confirmar que todos os poços contenham 200 microlitros com níveis uniformes de menisco e sem bolhas. Centrifugue a placa por dois minutos a 100G e, em seguida, incube-a por 16 a 18 horas sob condições padrão de incubação.

Centrifugue a placa por cinco minutos a 300G e descarte o sobrenadante. Lave todas as poças com 200 microlitros por poça de tampão para triagem de células por ativação de fluorescência ou tampão FACS. Prepare uma mistura-mestra de anticorpos de superfície no tampão FACS conforme apresentado aqui.

Re-suspenda as células em 50 microlitros por poço da mistura-mestra de anticorpos e misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos cinco vezes. Incube a placa por 15 minutos a quatro graus Celsius, envolta em folha de alumínio para proteger da luz. Adicione 150 microlitros por poço de tampão FACS.

Após a centrifugação, re-suspenda as células em 100 microlitros por poço de DAPI a cinco micromolares em tampão FACS. Prossiga imediatamente para a aquisição em citometria de fluxo sem incubação prévia à aquisição. Realize a citometria de fluxo utilizando o instrumento Cytek Aurora e registre os canais de fluorescência para CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI e quaisquer fluoróforos adicionais.

Durante a co-cultura, células efetoras, células-alvo vivas e células mortas foram visualizadas utilizando microscopia de células vivas em tempo real. As células NK-92 com CAR2 e CAR3 exibiram cinética de morte mais rápida do que as células NK-92 com CAR1, particularmente nos pontos iniciais de tempo e em uma razão igual de efetoras para alvo. A morte das células-alvo aumentou com razões maiores de efetoras para alvo, incluindo as células NK-92 controle, que demonstraram citotoxicidade natural.

Células NK-92 CAR2 e CAR3 demonstraram maior potência em proporções mais baixas de efetoras para alvo em pontos temporais posteriores. Embora potência aprimorada em proporções intermediárias de efetoras para alvo tenha sido observada em pontos temporais iniciais. Três parâmetros, KR50, KT50 e IKI-50, foram definidos para quantificar a potência das células CAR-NK-92, a cinética de morte e o desempenho citotóxico geral entre populações efetoras.

A adição de daratumumabe isoladamente não reduziu a sobrevivência das células-alvo, confirmando que o anticorpo não teve efeito direto sobre a viabilidade das células-alvo na ausência de células efetoras. A co-cultura com células NK isoladamente reduziu a sobrevivência das células-alvo a aproximadamente 70%, indicando citotoxicidade natural de base. A adição de daratumumabe reduziu ainda mais a sobrevivência celular para aproximadamente 37%, consistente com citotoxicidade mediada por anticorpos potencializada.

Em contraste, a condição controle de isotipo apresentou aproximadamente 62% de sobrevivência, comparável à condição de apenas NK. A desgranulação de células NK foi mais baixa na co-cultura de células NK com células-alvo sem anticorpo e mais alta na condição tratada com daratumumabe, em aproximadamente 31%, enquanto o controle de isotipo mostrou desgranulação intermediária em aproximadamente 19%. Este protocolo permite aos pesquisadores quantificar a citotoxicidade natural das células NK, avaliar o potencial de eliminação tumoral de projetos de CAR-NK e comparar a eficácia da ADCD de anticorpos monoclonais. Uma consideração fundamental ao realizar este protocolo é manter uma contagem precisa e consistente de células, pipetagem e semeadura de células NK e células-alvo, a fim de garantir resultados confiáveis e interpretáveis.

Estudos futuros podem aproveitar esses protocolos para explorar a evasão imunológica por células NK, comparar a suscetibilidade tumoral e avaliar novas imunoterapias baseadas em células NK em diferentes tipos de câncer.