Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

As mitocôndrias têm inúmeras funções na fisiologia celular, desde o metabolismo e produção de energia até a morte celular programada e a síntese de hormônios esteroides. Apesar da importância das mitocôndrias tanto nas funções celulares fundamentais quanto nas doenças, sabe-se muito pouco sobre a função mitocondrial em células-tronco embrionárias humanas e em seus descendentes diferenciados. Neste vídeo, mostraremos como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células-tronco embrionárias humanas podem ser analisados utilizando ensaios histoquímicos de atividade enzimática.

Olá, sou Ivan OV do laboratório de Michael Tetel do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Hoje vamos mostrar um procedimento para avaliar a função dos complexos respiratórios mitocondriais em células-tronco embrionárias humanas. Esta avaliação da atividade em gel envolve o isolamento de um extrato mitocondrial bruto de células-tronco embrionárias humanas, a separação dos complexos mitocondriais do sistema de fosforilação oxidativa por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo claro com alta resolução e, posteriormente, a detecção da atividade em gel.

Então vamos começar. O primeiro passo deste procedimento é isolar mitocôndrias de células-tronco embrionárias humanas. Para este ensaio, utilizaremos células-tronco embrionárias humanas que foram cultivadas em uma placa revestida com Matrigel, em condições livres de células de apoio.

Para coletar mitocôndrias de nossas células-tronco humanas, começamos lavando-as com PDS 1X morno, pH 7,4, e depois trypsinizamos as células por cinco minutos. Você pode usar um mililitro de tripsina 1X por poço em uma placa de seis poços. Após cinco minutos, é possível interromper a reação adicionando um volume igual de inibidor fresco de tripsina, um miligrama por mililitro em PBS 1X, e colher as células.

As células coletadas são então centrifugadas a 200 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e, em seguida, suspenda as células em forma de pellet em 0,8 a 1,7 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias gelado, contendo um coquetel recém-preparado de inibidor de protease na concentração 1 x. A quantidade de tampão utilizada depende do tamanho do pellet celular obtido. Após a suspensão do pellet, incube-o no gelo por cerca de 10 minutos.

Após a incubação, homogeneizamos as células com um homogeneizador, o que pode levar cerca de 40 a 50 movimentos. Podemos verificar a conclusão completa da homogeneização corando uma alíquota das células DOD com azul de trian e observando ao microscópio óptico. Deve ter uma aparência semelhante a esta.

Este é o primeiro disparo após 50 golpes com um downs. Este é o segundo disparo após 80 golpes com um downs. Uma vez que as células sejam homogeneizadas, centrifugue-as a 20.000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus C. Isso nos fornecerá um pellet mitocondrial bruto, que também conterá núcleos e fragmentos celulares maiores.

Antes da coleta do pellet, é necessário pesar o tubo de coleta para estimar o peso subsequente do pellet, derramar e descartar o sobrenadante e, em seguida, pesar o pellet mitocondrial bruto precipitado. Subtraindo-se o peso do tubo neste momento, pode-se prosseguir com a solubilização do pellet, o que será demonstrado no próximo passo. Para solubilizar o pellet mitocondrial bruto, começa-se mantendo o pellet em gelo e fazendo vortex com 35 microlitros de tampão de solubilização gelado.

Para cada 20 miligramas de pellet, temos informações detalhadas sobre os compostos do tampão mencionados no protocolo escrito anexo. Após a vórtex e a adição do tampão de solubilização e antes de adicionar a digitonina, transferimos o pellet re-suspendido para um tubo apropriado para centrifugação de alta velocidade e, em seguida, adicionamos 20 microlitros de digitonina a 10% (peso por volume) para cada 20 miligramas de peso do pellet, misturando mediante batidas leves no tubo; após mistura completa, incubamos o pellet mitocondrial por cinco a 10 minutos em gelo. Doil beta D multisídeo ou DDM ou Triton X-100 podem ser usados como substitutos da digitonina para solubilizar as proteínas.

A escolha do detergente e sua quantidade podem afetar a formação de supercomplexos ou formas multiméricas de complexos mitocondriais após a incubação no gelo. E uma vez que o pellet tenha sido solubilizado, centrifugaremos a amostra a cem mil vezes G por 15 minutos a quatro graus C; em seguida, coletaremos o sobrenadante límpido. Agora estamos prontos para preparar o sobrenadante para corrida em nosso gel em gradiente, para eletroforese nativa em gel com gradiente de densidade de mitocôndrias.

Recomendamos o uso de um gel de gradiente de acrilamida de cinco a 13% com um gel empilhador de 3,5%. Para preparar o gel, utilizaremos uma mistura de acrilamida e bis-acrilamida conforme descrito no protocolo escrito. A solução de acrilamida e bis-acrilamida é preparada previamente e armazenada a quatro graus Celsius em local escuro.

A acrilamida e a bisacrilamida são substâncias químicas tóxicas tanto na forma de pó quanto na forma líquida, portanto atenção especial deve ser dispensada ao manipulá-las. Nós combinamos a solução de acrilamida e bisacrilamida com uma alíquota de tampão gel três x, composto por 1,5 molar de ácido hexanóico seis amino e 75 milimolar de ole, em pH 7,0. A quantidade de solução de acrilamida e bisacrilamida que adicionamos ao tampão dependerá da porcentagem do gel que estamos preparando para fazer o gel em gradiente.

Vamos preparar uma mistura a 4% e uma mistura a 13%, e o gel de empilhamento será uma mistura a 3,5%. Não se esqueça de adicionar glicerol à mistura a 13%. Quando as três misturas estiverem prontas, adicionamos uma quantidade apropriada de persulfato de amônio e TEMED às misturas e despejamos as misturas em uma câmara de moldagem com formador de gradiente.

A parte esquerda da câmara contém a mistura 5%. A parte direita da câmara contém a mistura 13% com um pequeno bastão magnético de agitação. Iniciamos o despejo do gel abrindo a parte direita da câmara.

Em seguida, abrimos imediatamente a parte esquerda da câmara e deixamos a solução a 5% se misturar com uma solução a 13% para formar o gradiente. Adicionamos uma pequena quantidade de isopropanol sobre o gel para formar uma borda nítida e reta após a polimerização. Aproximadamente uma hora depois, quando a polimerização do gel em gradiente estiver completa, removemos o isopropanol e despejamos o gel de empilhamento a 3,5% no aparelho, inserindo um pente para gel.

Vamos montar e executar os géis em uma câmara fria com temperatura entre quatro e sete graus Celsius. Para executar este gel, utilizaremos dois tampões diferentes. Na câmara do ânodo, usaremos um tampão contendo ácido clorídrico 25 milimolar, pH 7,0.

O tampão catódico conterá 50 milimolar de tric, 7,5 milimolar de ácido ole clorídrico, 0,02% peso por volume, doil beta D multisídeo ou DDM e 0,05% peso por volume, desoxi coato pH 7,0. Para preparar o sobrenadante a ser corrido no gel que acabamos de preparar, adiciona-se tampão de carregamento para obter uma concentração final de 5% peso por volume de glicerol e 0,01% peso por volume. Ponto S, normalmente adicionamos uma solução estoque 10x contendo glicerol e poncho s diretamente aos sobrenadantes.

Agora estamos prontos para carregar a amostra no gel. Vamos carregar os poços do gel com um volume que contenha de 20 a 40 miligramas de proteína mitocondrial bruta por via. Imediatamente após o carregamento, o gel é corrido a 100 volts.

Uma vez que a amostra tenha entrado no gel de empilhamento, a voltagem pode ser aumentada para 500 volts, com a corrente limitada a 15 miliampères. Embora normalmente executemos o gel durante a noite a 70 a 100 volts, interrompemos a eletroforese quando uma linha nítida do corante vermelho de zos se aproxima da frente do gel. Agora que o gel foi corrido, podemos analisar a atividade de diferentes complexos proteicos diretamente no gel.

O tempo de incubação para cada ensaio depende da eficiência da solubilização da proteína e da quantidade de material carregado por poço. Os complexos um, quatro e cinco geralmente produzem sinais mais fortes do que os complexos dois e três. Por isso, o tempo de coloração para os complexos dois e três deve ser mais longo.

Para testar a atividade do complexo, precisaremos usar tampões específicos para cada complexo. Você pode encontrar os ingredientes dos tampões individuais no protocolo escrito. Agora, cortaremos as faixas individuais do gel para realizar os ensaios de atividade em gel separadamente.

Para todos os complexos, incubar o fragmento de gel na respectiva solução tampão por várias horas à temperatura ambiente, exceto para o complexo cinco. Após a incubação, fixar o gel em 50% metanol e 10% ácido acético por 15 a 45 minutos. O gel fixado é conservado em 10% ácido acético.

Você vê aqui como aparece a coloração do complexo I. Há uma única faixa roxa-escura no corte do gel que corresponde ao complexo I. Géis claros permitem realizar densitometria a partir das atividades dos complexos mitocondriais e realizar análises comparativas.

Após a citometria densa, normalmente secamos as fatias de gel para armazenamento de longo prazo e/ou para digitalização, a fim de obter uma imagem de alta qualidade. Os complexos dois, três e quatro coram com a mesma cor roxa. Ambos exibem uma faixa de coloração alaranjada ou amarelada. Abaixo estão exemplos das atividades de coloração dos complexos dois, três e quatro.

Acabamos de mostrar como analisar a atividade de complexos exsudativos mitocondriais, extraídos de células-tronco embrionárias humanas e separados por eletroforese em gel nativo de alta resolução. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.