Isolamento de neutrófilos Protocolo
23 de julho de 2008
Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.
Protocolo de isolamento de neutrófilos. Este procedimento irá extrair células sanguíneas brancas de uma amostra de sangue total usando equipamentos como centrífuga e frascos. Vortex, seringa com agulha e filtro de seringa.
Milli para marca MX gv 0,22 materiais micrométricos. A solução salina de Hank e a solução para separação de neutrófilos requerem dois tipos de soluções HBSS. HBSS com cloreto de cálcio será usada para preparar uma solução com albumina sérica humana.
HBSS sem cloreto de cálcio será usado para suspender e lavar os neutrófilos. Tenha cuidado especial para usar a solução de HBSS apropriada neste procedimento. A albumina sérica humana ou HSA é uma proteína no plasma sanguíneo que mantém o pH e a pressão osmótica.
Não utilize o tampão de lise de hemácias contendo amálgama de soro bovino. Este é fabricado pela Roche Diagnostics, meio de isolamento de neutrófilos NIM Cedar Line Labs, meio de separação Lymph light Poly, protegido da luz e mantido sob refrigeração para melhores resultados. Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente no momento do uso.
Retire os reagentes da geladeira uma hora antes do experimento. Prepare a solução H-B-S-S-H-S-A para separação de neutrófilos. Pipete o HBSS com cloreto de cálcio no frasco.
Aspire a HSA para a seringa. Evite aprisionar bolhas de ar. Remova a agulha da seringa e substitua-a pelo filtro.
Injete HSA através de filtro no frasco de HBSS e vorteie para misturar quando os outros materiais estiverem prontos e em temperatura ambiente; colete cerca de 15 mililitros de sangue total. Isso produzirá de 10 a 15 mililitros de 10 à oitava potência de neutrófilos. O doador não deve ter ingerido álcool nem medicamentos sem prescrição nas 24 horas anteriores à doação da amostra de sangue.
Estes podem interromper o processo de separação. O sangue total pode ser anticoagulado com citrato de EDTA ou heparina, adicionando nove partes de sangue a uma parte de citrato de sódio K3 EDTA ou heparina, seguindo as instruções do fabricante. Os seguintes passos serão descritos neste procedimento.
Sequencie e remova o plasma e os monócitos. Separe e obtenha uma camada de neutrófilos lisando as células vermelhas para obter neutrófilos em suspensão livre na primeira separação. Obtenha os neutrófilos na camada NIM.
Colete cinco mililitros do meio de isolamento em um tubo de centrífuga. Colocar o meio de isolamento na parte inferior do tubo permite que ele atue como um filtro, já que a centrífuga forçará o sangue a passar por ele cuidadosamente. Sobreponha cinco mililitros de sangue ao NIM para uma separação limpa.
Tenha muito cuidado para evitar a mistura das soluções. Realize este passo lentamente e com cuidado, mantendo a ponta da pipeta próxima à superfície do meio resolução para prevenir a mistura. A solução a 500 RCF por 35 minutos.
A 20 a 25 graus Celsius, o sangue deve se separar em seis faixas distintas. As seis faixas são plasma, monócitos, meio de isolamento, neutrófilos, mais meio de isolamento e o pellet de hemácias na parte inferior. Se essas seis faixas não estiverem nítidas e bem definidas, o processo de separação não foi realizado corretamente e precisará ser repetido.
As causas comuns de má separação incluem o doador do meio de isolamento antigo ter consumido álcool nas últimas 72 horas ou ter ingerido outros medicamentos, como Tylenol ou aspirina. Remova e descarte cuidadosamente o plasma, os monócitos e o meio de isolamento. Coloque essas camadas em um tubo selável e descarte; pipete cuidadosamente a camada de neutrófilos e todo o meio de isolamento sob os neutrófilos para um tubo cônico limpo a fim de recuperar o maior número possível de neutrófilos.
Normalmente, é mais fácil incluir também um pouco do meio de isolamento da camada inferior. Não perturbe o pellet na parte inferior. Segunda declaração, refinar a camada de neutrófilos.
Dilua a solução de neutrófilos para 10 mililitros com HBSS sem cálcio. Inverta o tubo algumas vezes para suspender as células antes da centrifugação. A solução de neutrófilos.
350 ×g por 10 minutos. A 20 a 25 graus Celsius, um precipitado vermelho deve estar presente no fundo do tubo contendo neutrófilos e hemácias residuais. Remova o sobrenadante com a pipeta.
Tenha cuidado para não perturbar o pellet no fundo. Lisando as células vermelhas do sangue.
As células vermelhas do sangue na amostra devem agora ser destruídas por lise. Para lisar as células vermelhas residuais, adicione dois mililitros de tampão de lise de células vermelhas ao tubo para ressuspender. Suspenda o pellet e vortexe o frasco em uma configuração de três a quatro.
Evite aumentar a velocidade do vórtex acima de quatro, pois isso pode causar a ativação dos neutrófilos. Pode ser necessário vortexar por vários segundos ou pulsar o vórtex para dissolver o palato. Centrifugue a solução de lise a 250 RCF por cinco minutos.
Utilize a opção de partida suave para minimizar danos à amostra. Remova o sobrenadante com pipeta. Repita o processo de lise.
Se necessário, para liberar a suspensão de neutrófilos, adicione 500 microlitros de HBSS sem cálcio a cada tubo. Vortexe o pellet em um ajuste de três a quatro, dilua para 10 mililitros com HBSS sem cálcio e centrifugue os neutrófilos a 250 RCF durante cinco minutos. Aspire o sobrenadante e descarte.
Re-suspenda o pellet em 250 microlitros de solução de HBSS com HSA, duas vezes 10 à sexta. Neutrófilos por mililitro são tipicamente coletados.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para o isolamento de neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando uma técnica padrão de separação por gradiente de densidade. Os neutrófilos desempenham um papel crucial na resposta imune inflamatória, e o entendimento de seu isolamento é essencial para pesquisas futuras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Neurociência
Contexto
- Os neutrófilos estão entre os primeiros respondentes nas respostas inflamatórias.
- Suas funções e mecanismos foram amplamente estudados in vitro.
- Técnicas de isolamento são essenciais para o estudo do comportamento e das funções dos neutrófilos.
- Métodos padronizados melhoram a reprodutibilidade nas pesquisas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para o isolamento de neutrófilos a partir do sangue humano.
- Facilitar pesquisas adicionais sobre as funções dos neutrófilos na inflamação.
- Fornecer um protocolo que possa ser facilmente adotado em laboratórios.
Métodos Utilizados
- Método de separação por gradiente de densidade.
- Uso de meios de separação disponíveis comercialmente.
- Equipamentos incluem centrífuga e frascos.
- Preparação de soluções utilizando HBSS com cloreto de cálcio e albumina sérica humana.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de neutrófilos a partir de amostras de sangue total.
- Demonstração da eficácia do método de separação.
- Oferecimento de um protocolo claro para pesquisadores.
- Aplicações potenciais no estudo do comportamento dos neutrófilos em diversas condições.
Conclusões
- O método apresentado é eficaz para o isolamento de neutrófilos.
- Este protocolo pode aprimorar pesquisas sobre respostas imunes.
- Estudos futuros podem se basear nesta técnica de isolamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O aislamento confiável de neutrófilos é fundamental para pesquisas iniciais em imunologia e inflamação, permitindo estudos funcionais precisos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos. Preparações de neutrófilos com alta pureza e alta viabilidade sustentam uma sólida validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios quantitativos, impactando diretamente a confiança preditiva em pontos cruciais de inflexão do portfólio. Protocolos padronizados de isolamento facilitam a reprodutibilidade e a integração de dados entre equipes de descoberta e translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias específicas de neutrófilos e mecanismos imunológicos relevantes para inflamação e oncologia.
- Apoia a validação funcional de alvos ao fornecer populações puras e viáveis de neutrófilos para ensaios subsequentes.
- Reduz a ambiguidade biológica, fortalecendo a confiança preditiva em testes iniciais de hipóteses.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece amostras padronizadas de neutrófilos com alta viabilidade para ensaios in vitro reprodutíveis.
- Facilita a medição quantitativa de funções de neutrófilos, como fagocitose e produção de citocinas.
- Permite escalonamento de ensaios e reutilização da plataforma para triagem de compostos e estudos mecanicistas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Fornece material celular relevante para a modelagem de respostas inflamatórias em sistemas pré-clínicos.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, mantendo a função e viabilidade celular.
- Alinha-se a estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir leituras funcionais em células imunes humanas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de isolamento de neutrófilos por gradiente de densidade integra-se na interface entre a fase inicial de descoberta e o desenvolvimento de ensaios, apoiando fluxos de trabalho desde a validação de alvos até a pesquisa pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Fornece neutrófilos puros para estudos funcionais orientados por hipóteses e análise de vias.
- Triagem: Fornece insumos quantitativos e reprodutíveis para ensaios celulares na avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição da viabilidade celular, pureza e resultados funcionais para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos utilizando células imunes humanas primárias.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado adaptável a múltiplos programas de pesquisa e áreas de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a incerteza mecanicista em estudos de células imunes.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade, padronização e escalabilidade de ensaios baseados em neutrófilos.
- Valor Estratégico: Aprimora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir dados robustos precocemente.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em inflamação e imunologia.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência técnica em separação por gradiente de densidade e manipulação de células.
- Exige acesso a equipamentos de centrifugação, reagentes estéreis e meios de separação validados.
- Exige rigoroso cumprimento dos controles de tempo e temperatura para preservar a viabilidade celular.
- Necessita padronização entre equipes para obter resultados reprodutíveis em diferentes estudos.
- Limitado pela variabilidade entre doadores e pela curta vida útil dos neutrófilos, exigindo uso rápido em etapas subsequentes.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
