Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

A tecnologia de cultivo de tecidos tem encontrado ampla aplicação na área da biologia celular. No entanto, células cultivadas exigem manutenção regular para permanecer saudáveis. Quando as células atingem a confluência, devem ser subcultivadas ou repassadas.

A falha em fazê-lo resulta em crescimento reduzido e, eventualmente, morte celular. Neste vídeo, demonstramos como manter células em cultura de tecidos, tanto para linhagens celulares aderentes quanto em suspensão. Olá, sou Ricky, do Laboratório do Dr. LAN, nas Instalações de Laboratórios de Patologia Molecular no Leste do Tennessee.

Hoje quero mostrar a você duas técnicas para o envasamento de células em suspensão e células aderentes. Para repicar uma placa de células, devemos começar com um cultivo primário crescido até a confluência em uma placa de Petri de 60 milímetros ou em um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados contendo cinco mililitros de meio de cultura de tecidos.

Iniciamos removendo todo o meio da cultura primária com a pipeta estéril. Em seguida, lavamos a monocamada de células aderidas uma ou duas vezes com um pequeno volume de HBSS a 37 graus Celsius sem cálcio e magnésio. Para remover qualquer soro bovino fetal residual que possa inibir a ação da enzima tripsina que será adicionada na próxima etapa.

Em seguida, adicione quantidade suficiente de solução morna de tripsina-EDTA ao cultivo para cobrir a camada de células aderentes. Então, coloque a placa em uma bandeja aquecida a 37 graus Celsius por um a dois minutos. Após a incubação, bata suavemente na parte inferior da placa sobre uma superfície plana para desprender as células.

Verifique o cultivo com um microscópio invertido para garantir que as células estejam arredondadas, o que indica que estão desprendidas da superfície. Se as células não estiverem suficientemente desprendidas, retorne a placa à bandeja aquecida por mais um ou dois minutos. Após observar pelo microscópio, lave a placa com meio completo e pipete a suspensão para um tubo cônico de 15 mil contendo dois mililitros de meio completo.

Centrifugue as células para formar o pellet e reconstitua o pellet em meio completo. Agora, adicione um volume igual de suspensão celular a cada uma das placas novas que foram devidamente identificadas. Alternativamente, as células podem ser contadas usando um hemocitômetro e diluídas até a densidade desejada, de modo que um número específico de células possa ser adicionado a cada placa.

Certifique-se de rotular cada placa com a data da subcultura e o número de passagem. Após adicionar a suspensão celular, coloque um mililitro de meio fresco em cada nova cultura. Incube, agora, as placas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO₂.

Após incubar as células durante a noite, adicione meio fresco às placas e coloque-as novamente a 37 graus. Assim que a placa atingir confluência, você pode repicar as células novamente repetindo este procedimento e continuar a repicar conforme necessário. Agora vamos mostrar como repicar células em cultura de suspensão.

Cultivar células em suspensão é mais simples do que cultivar células aderentes. Antes de envasar culturas em suspensão, as células devem ser mantidas com alimentação a cada dois ou três dias até atingirem a confluência, momento em que as células se agregam na suspensão e o meio aparece turvo. Quando o frasco é agitado suavemente.

Para fazer isso, retire o frasco com as células em suspensão do incubador, tomando cuidado para não perturbar aquelas que se depositaram no fundo do frasco. De forma asséptica, remova e descarte cerca de um terço do meio do frasco e substitua-o por um volume igual de meio pré-aquecido a 37 graus Celsius. Após a troca do meio, agite suavemente o frasco e devolva-o ao incubador, mantido a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.

Se houver menos de 15 mililitros, coloque o meio no frasco e incube o frasco em posição horizontal para aumentar o contato entre as células e o meio. Caso contrário, o frasco pode ser incubado na posição vertical nos dias em que as culturas não forem alimentadas. Verifique-os agitando suavemente as placas para ressuspender as células.

Certifique-se de observar quaisquer alterações de cor no meio que indiquem bom crescimento metabólico. Quando os cultivos estiverem confluentes, o que deve corresponder a cerca de 2,5 milhões de células por mil, você poderá repicá-los. Mais uma vez, mostramos como repicar células cultivadas, tanto para cultivos aderentes quanto em suspensão.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte em todos os seus experimentos.