Análise immunoblot

A imunodetecção, frequentemente denominada "Western blot", é utilizada para identificar, em uma amostra proteica, antígenos específicos reconhecidos por anticorpos policlonais ou monoclonais. Este procedimento geralmente sucede a eletroforese em gel unidimensional ou bidimensional e envolve a transferência de proteínas separadas para membranas de nitrocelulose. A incubação dessas membranas com anticorpos primários e secundários, conjugados direta ou indiretamente a enzimas, e a visualização de antígenos proteicos nessas membranas por meio de reações com substratos coloridos ou fluorescentes.

Neste vídeo, apresentamos uma demonstração passo a passo de um procedimento de blotting imunológico. Olá, sou Sean Gallagher da UVPI, colaborando com um centro proteômico aqui no Instituto de Pós-Graduação KE. Hoje vou mostrar a vocês a análise de blotting imunológico.

Envolve uma série de etapas, incluindo separação de proteínas, transferência das proteínas para membranas, detecção imunológica e visualização com substratos cromogênicos e quimioluminescentes. Então, vamos começar. Antes de iniciar o procedimento de imunodetecção, as amostras de proteína devem primeiro ser separadas por eletroforese utilizando géis unidimensionais ou bidimensionais de tamanho pequeno ou padrão.

Prepare as amostras antigênicas e carregue-as nas pistas do gel, incluindo proteína marcada com corante pré-fixado ou biotinilada e padrões de peso molecular em uma ou mais pistas do gel. Esses marcadores proteicos serão transferidos para a membrana e indicarão convenientemente a orientação da membrana e os tamanhos das proteínas após a imunomarcação. Uma vez concluída a eletroforese, estamos prontos para montar o imunoblot.

Para montar o blot imunológico, primeiro desmonte o sanduíche de gel e remova o gel de empilhamento. Equilibre o gel por 30 minutos à temperatura ambiente em tampão de transferência; essa equilibração é necessária para evitar uma alteração no tamanho do gel durante a transferência. Enquanto o gel está em equilíbrio, comece a montar o sanduíche de transferência em uma bandeja grande o suficiente para acomodar a cassete plástica de transferência, preenchida com tampão de transferência de modo que a cassete fique coberta. Agora, coloque uma almofada Scotch-Brite ou esponja na metade inferior da cassete plástica de transferência.

Em seguida, pegue uma folha de papel filtro recortada com o mesmo tamanho do gel. Umedeça-a previamente com tampão de transferência e coloque-a sobre a almofada Scotch Bright. Após a conclusão da equilibração do gel de 30 minutos, posicione o gel sobre o papel filtro.

Remova quaisquer bolhas de ar entre o gel e o papel filtro rolando suavemente um tubo de ensaio ou bastão de vidro sobre a superfície do gel. Alternativamente, você pode usar o rolo da BioRad, que acompanha o kit da BioRad. Lembre-se de usar luvas ao manipular papéis filtro, géis e membranas.

O óleo das suas mãos irá bloquear a transferência. Em seguida, prepare a membrana de transferência. Corte a membrana no mesmo tamanho do gel, acrescentando um a dois milímetros em cada borda.

Em seguida, coloque lentamente a membrana na água destilada com uma borda em um ângulo de 45 graus; a água será absorvida pela membrana e, eventualmente, umedecerá toda a superfície. Se for inserida muito rapidamente na água, o ar ficará aprisionado e aparecerá como manchas brancas na membrana. A proteína não será transferida para essas áreas.

Uma vez que a membrana esteja completamente úmida, equilibre-a por 10 a 15 minutos no tampão de transferência. Este procedimento de umedecimento funciona para membranas de nitrocelulose e nylon. Apenas as membranas de PVDF são hidrofóbicas e não ficarão úmidas simplesmente ao serem colocadas em água destilada ou tampão de transferência.

As membranas de PVDF devem primeiro ser imersas em metanol a 100% por um a dois segundos e, em seguida, equilibradas por 10 a 15 minutos em tampão de transferência. Não deixe a membrana secar em momento algum.

Se isso ocorrer, umedeça novamente com metanol e, em seguida, com o tampão de transferência. Uma vez que a membrana esteja pronta, coloque a membrana previamente umedecida diretamente sobre a face superior do gel. Lembre-se de remover todas as bolhas de ar entre o gel e a membrana, rolando suavemente um tubo de ensaio, uma haste de vidro ou um rolo da BioRad sobre a superfície da membrana.

Em seguida, umedeça outro pedaço de papel-filtro Watman de 3 mm. Coloque-o sobre a membrana e novamente remova todas as bolhas de ar. Em seguida, coloque outro disco Scotch-Brite ou esponja sobre este papel-filtro.

Complete a montagem do sanduíche do imunoblotagem travando a metade superior da cassete de transferência no lugar. Agora que o sanduíche do imunoblotagem está montado, estamos prontos para transferir as proteínas do gel para a membrana. Para iniciar o procedimento de transferência, encha o tanque de eletroblotagem com tampão de transferência e coloque a cassete contendo o sanduíche no aparelho de eletroblotagem.

É importante posicionar o sanduíche de modo que a membrana fique voltada para o ânodo ou lado positivamente carregado do tanque. Conecte os cabos da fonte de alimentação às respectivas faces do ânodo e do cátodo do aparelho de eletrotransferência. Este aparelho de transferência específico vem com um bloco de gelo para refrigeração.

Agora, realize a transferência eletroforética das proteínas do gel para a membrana por 30 a 60 minutos a 50 volts com refrigeração ou durante a noite a 14 volts em câmara fria. Quando a transferência estiver concluída, desligue a fonte de alimentação e desmonte o aparelho. Em seguida, remova a membrana do sistema de transferência e anote a orientação cortando um dos cantos.

Neste momento, as membranas podem ser secas e armazenadas em saco plástico com fechamento hermético a quatro graus Celsius por um ano. Antes de qualquer processamento adicional, as membranas de PVDF secas devem ser colocadas em uma pequena quantidade de metanol a 100% para umedecer a membrana. Em seguida, em água destilada para remover o metanol.

Uma vez marcada a orientação, corar o gel para verificar a eficiência da transferência. Para visualizar as proteínas transferidas, você pode corar a membrana reversivelmente com rubi de cipro ou irreversivelmente com tinta da índia azul de kamasi, azul de naftol ou ouro coloidal. Esses procedimentos de coloração irreversível são incompatíveis com membranas de náilon.

Agora que as proteínas foram transferidas para a membrana, prossiga com a detecção imunológica e visualização das proteínas. Nesta etapa, as proteínas imobilizadas na membrana são incubadas com anticorpos específicos para identificar e quantificar quaisquer antígenos presentes. Para iniciar, coloque a membrana em uma bandeja de incubação plástica com 20 mililitros de tampão bloqueador.

Algumas pessoas usam bolsas, mas as placas são frequentemente utilizadas como alternativa, pois são especialmente úteis ao processar um grande número de tiras em diferentes soluções de anticorpo primário. Em seguida, incubar a membrana vedada por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente com agitação em agitador orbital ou plataforma oscilante. Enquanto a membrana está em incubação, diluir o anticorpo primário e o tampão bloqueador.

A diluição é determinada empiricamente, mas normalmente varia de um para 100 a um para 1000. Para um anticorpo policlonal, de um para 10 a um para 100 para sobrenadantes híbridos e maior que um para 1000 para fluido ascítico murino contendo anticorpos monoclonais. Após a incubação, descarte o tampão de bloqueio.

Substitua o tampão pelo anticorpo primário diluído e, novamente, incube por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente com agitação constante. Em seguida, lave a membrana quatro vezes com agitação utilizando 100 mililitros de TTBS para filtros de NITROCELULOSE ou PVDF ou TBS para filtros de nylon.

Lave por 10 a 15 minutos a cada vez enquanto a membrana está sendo lavada, dilua o anticorpo secundário no tampão de bloqueio. Exemplos de anticorpos secundários incluem peroxidase do rábano-forte ou fosfatase alcalina, conjugado anti-Ig, enzima conjugada comercialmente disponível. Os anticorpos secundários geralmente são diluídos de um para 200 a um para 25.000 antes do uso.

Após a conclusão das etapas de lavagem e descarte dos materiais de lavagem, adicione o conjugado anti-Ig de peroxidase do rabanete ou fosfatase alcalina diluído e incube de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente com agitação constante. Após 30 a 60 minutos, remova a membrana do recipiente e lave-a quatro vezes, por 10 a 15 minutos cada vez, em TTBS, conforme descrito anteriormente.

Uma vez concluídas as lavagens, estamos prontos para prosseguir com a etapa de visualização. Mas primeiro, demonstraremos um procedimento alternativo de imunomarcação. Este procedimento alternativo de imunomarcação baseia-se no kit Vector Stain ABC da Vector Labs.

Utiliza um complexo avidina-biotina para ligar a peroxidase do rabanete ou HRPO ou fosfatase alcalina AAP ao anticorpo secundário biotinilado. Hoje demonstraremos o kit de HRPO. O TTBS é particularmente adequado como tampão de bloqueio para sistemas de avidina-biotina.

Mas para filtros de náilon, recomenda-se o uso de reagentes de ligação proteica, pois o leite desnatado em pó contém biotina residual, que irá interferir no imunoensaio. Ele deve ser usado apenas na etapa de bloqueio, começando pelo equilíbrio da membrana em tampão de bloqueio em uma bandeja aberta com agitação constante utilizando um agitador orbital ou plataforma oscilante. Incube a membrana por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente enquanto a membrana estiver em equilíbrio.

Prepare a solução de anticorpo primário. Use TTBS para membranas de NITROCELULOSE ou PVDF com sistemas de Biotina de alta sensibilidade Aden.

A diluição de cera contendo anticorpo primário geralmente varia de um em 1000 a um em 100.000. O uso de química quimioluminescente exige a faixa mais alta de diluições. No nosso caso, demonstrando cromogênico.

Estamos utilizando uma diluição de um para 5.000 do anticorpo primário. Após a equilibração, remova o tampão de bloqueio. Em seguida, adicione quantidade suficiente de solução de anticorpo primário para cobrir a membrana.

Incube a membrana por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave após 30 minutos. Lave a membrana três vezes em TTBS para nitrocelulose em intervalos de cinco minutos. Durante a etapa de lavagem, prepare a solução de anticorpo secundário biotinilado diluindo uma gota de anticorpo biotinilado em 10 mililitros de TTBS. Após a conclusão das etapas de lavagem, adicione a solução de anticorpo secundário.

Incube a membrana por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação lenta enquanto a membrana estiver sendo incubada com o anticorpo secundário. Prepare a avidina biotina HRPO para fazer isso. Misture duas gotas do reagente A do corante vti e duas gotas do reagente B em 10 mililitros.

TTBS para nitrocelulose. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente quando a incubação com o anticorpo secundário estiver concluída. Lavar a membrana três vezes ao longo de um período de 15 minutos com TTBS ou TBS.

Em seguida, adicione a solução enzimática de avidina biotinilada à membrana e incube por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação lenta. Em seguida, lave a membrana três vezes em intervalos de 10 minutos com TTBS. Agora que o procedimento de imunodetecção está concluído, as proteínas ligadas à membrana estão prontas para serem visualizadas com substratos cromogênicos.

Para esta etapa final de visualização, os substratos CN-DAB/ICL-2 e TMB são comumente utilizados com procedimentos de imunodetecção baseados em peroxidase de rábano. Se a lavagem final da membrana durante o procedimento de imunodetecção foi realizada em TTBS, lave a membrana por 15 minutos à temperatura ambiente com 50 mililitros de TBS. Coloque agora a membrana na solução cromogênica de visualização.

As bandas proteicas devem aparecer entre 10 e 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, descarte a mistura de reação do substrato e encerre a reação adicionando água destilada. O teste imunoenzimático é um procedimento de múltiplas etapas usado por milhares de laboratórios para detectar a presença de proteínas específicas após eletroforese unidimensional ou bidimensional.

Acabei de mostrar como realizar uma análise sanguínea imunológica. É isso aí. Boa sorte com seus experimentos e obrigado por assistir.