Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

O preparo de células dendríticas a partir da medula óssea fornece uma excelente fonte de células apresentadoras de antígeno que podem ser utilizadas em experimentos in vitro ou in vivo em duas imagens do sistema imunológico. A introdução de células apresentadoras de antígeno permite o estudo de interações específicas entre células antígeno-dependentes no contexto do linfonodo vivo. Aqui demonstramos o isolamento asséptico da medula óssea e técnicas de cultura para a produção de células dendríticas maduras.

Além disso, acompanhamos o desenvolvimento de células dendríticas do dia um ao dia 11. Esse desenvolvimento é mostrado por meio de imagens fixas e vídeos do incubador obtidos com a tecnologia Incus Site da Scent Technologies. Por fim, mostramos células dendríticas derivadas da medula óssea apresentando antígeno Cove a linfócitos T OT dois no linfonodo espelhado.

Olá, sou Melanie Matthew no laboratório de Micah Halen na Universidade da Califórnia nas proximidades. Você já se perguntou o que acontece internamente durante o prober enquanto suas células estão crescendo? Hoje?

Como parte do nosso protocolo, vamos mostrar como usar alguns instrumentos no local. O inky site permite acompanhar o crescimento de culturas celulares no seu incubador. Neste protocolo, vamos mostrar como isolar e preparar células derivadas da medula óssea e grupos celulares de camundongo.

Então, a primeira coisa que vou mostrar como fazer é remover os ossos do fêmur e isolar a medula óssea. Primeiro, prenda o animal. Em seguida, umedeça o animal com etanol a 70%. Faça a primeira incisão ao longo da linha média do animal.

Em seguida, corte dentro da perna conforme estou mostrando aqui. Para expor o tecido muscular acima do fêmur, você deverá ser capaz de afastar o músculo e segurar o grande osso do fêmur com a pinça de dissecação. Enquanto segura o osso com a pinça de dissecação, desça ao longo do osso e faça o primeiro corte logo abaixo da articulação.

Em seguida, mova a tesoura ao longo do comprimento do fêmur e corte o mais próximo possível do corpo. Isso pode resultar em um pouco de sangue, especialmente se a artéria femoral for cortada. Ao remover o fêmur, é extremamente importante que o osso permaneça intacto.

Como você pode ver aqui, as extremidades do osso não foram cortadas nem danificadas. Após a remoção do fêmur, retire quaisquer tecidos adicionais e coloque o fêmur em um pequeno recipiente com nosso meio PMI. Ao remover tecidos adicionais, certifique-se de que o osso do fêmur não seque.

Neste momento, os ossos do fêmur devem ser transferidos para uma placa contendo etanol a 70% e colocados sobre gelo por cinco a dez minutos. Para fins deste vídeo, continuaremos na bancada do laboratório. No entanto, nesta etapa do experimento, todo o procedimento deve ser transferido para uma câmara de cultura de tecidos.

Uma vez que os ossos tenham sido imersos em etanol, você pode transferi-los para um recipiente maior contendo meio estéril para a remoção da medula óssea. Agora estamos prontos para remover e ressuspender a medula óssea. Encha uma seringa de insulina com meio estéril e coloque-a ao lado para uso posterior.

Segure o osso com suas pinças estéreis. Mantenha-o sobre uma pequena placa para pedaços descartados e corte a epífise ou as extremidades do osso de cada lado. Insira sua seringa de insulina em um dos lados do osso e lave a medula para fora do osso em 15 mililitros de meio.

Lave o osso mais uma ou duas vezes até que toda a medula seja removida. Assim que a medula for completamente eliminada do osso, ele ficará quase totalmente branco. Coloque o osso limpo no recipiente de descarte e repita o processo com o outro fêmur.

Uma vez concluído isso, perturbe suavemente quaisquer fragmentos de medula que não foram separados pelo processo de lavagem para criar uma suspensão de células simples. Isso levará de cinco a dez minutos de pipetagem. Coloque uma suspensão de células simples em um tubo cônico de 50 mil, lavando a placa pelo menos três vezes com 10 mils de meio.

Toda vez, centrifugue as células, remova o meio e re-suspenda as células pressionando firmemente e rapidamente os dedos contra o fundo do tubo. Para remover os glóbulos vermelhos ou hemácias, realizamos uma lise com água. Outro método para remoção de glóbulos vermelhos é a lise com cloreto de amônio.

Os dois métodos foram descritos em artigos anteriores do JoVE em formato de vídeo. O isolamento de células T CD4 positivas de linfonodos de camundongos utilizando o sistema de purificação Milan max no JoVE edição nove e a preparação do fator de crescimento de células T a partir de células de rato no JoVE edição 10.

Após a remoção das suas hemácias, você está agora pronto para ser cultivado. Então, antes de apresentar o cultivo de células dendríticas, gostaria de introduzi-lo ao local incus. O local incus permitirá subtrair o crescimento previsto do cultivo celular dentro do incubador, para que possamos observar a nós mesmos em como nos comportamos ou nos comportamos inadequadamente.

Uma vez que um cultivo é preparado, você o coloca na bandeja de tamanho apropriado e fecha o compartimento do incus. Em seguida, no seu computador, basta definir o intervalo de tempo, escolher os poços que deseja imaginar e deixar o compartimento do incus coletar os dados para você. Os vídeos apresentados neste protocolo demonstram as alterações na morfologia de células dendríticas in vitro.

Esses vídeos foram exportados diretamente do programa do site Incus. Conforme as células dendríticas se desenvolvem do dia um ao dia 11, é possível observar uma mudança real na morfologia, pois elas aumentam de tamanho e assumem o fenótipo de célula dendrítica. Após a lise, os eritrócitos são removidos e as células são lavadas em meio primário para células dendríticas e semeadas a 5 milhões por mililitro.

Essas células devem ser inicialmente cultivadas em meio de cultura de células dendríticas primárias, e posteriormente são cultivadas em meio secundário para DCs, suplementado com 40 nanogramas por mililitro de IL-4 e 100 nanogramas por mililitro de TNF-alfa. Essas citocinas auxiliarão no desenvolvimento de células dendríticas maduras que se assemelham às células dendríticas derivadas de monócitos. Agora vou mostrar como as culturas se apresentam durante o desenvolvimento e como mantê-las ao longo do tempo.

Depois de semear as células, você pode cultivar as células dendríticas por 72 horas antes da primeira troca de meio. Assim é como ficará o seu cultivo típico logo após o semeador das células no primeiro dia. E esta é a aparência das células.

No terceiro dia, é possível observar que as células começaram a aderir à placa, mas ainda não assumiram o fenótipo clássico de célula dendrítica. No quarto dia, remova o meio e adicione 10 mililitros de meio fresco para cultura primária de DCs, aspirando o meio anterior. No quarto dia, removeremos linfócitos e quaisquer outras células não aderentes.

Agora você pode recolocar as culturas no incubador por mais três dias, sete dias após o plaqueamento inicial. Veja como será a aparência da sua cultura típica. É possível perceber que já está na hora de dividir as células e replacá-las.

No sétimo dia, as células dendríticas são removidas da placa aspirando o meio e, em seguida, adicionando EDTA estéril 300 milimolar e incubando por cinco minutos. Em seguida, a placa é lavada repetidamente mantendo-a em um ângulo de 45 graus e pipetando a solução de EDTA contra a parte traseira da placa. Esse procedimento é realizado por vários minutos para garantir a remoção de todas as células dendríticas aderentes.

As células são coletadas em um tubo cônico de 50 mililitros e lavadas duas vezes com meio DC secundário. Em seguida, as células são ressuspendidas e semeadas a 5 milhões de células por placa. As células dendríticas do dia sete recém-semeadas sedimentam rapidamente no fundo da placa, aderem e começam a se espalhar.

Como você pode ver aqui no vídeo do local Zichy, este vídeo foi gravado no incubador ao longo de dois dias para mostrar o desenvolvimento das células dendríticas a partir do replante inicial realizado no sétimo dia até o início do nono dia. As células dendríticas morfológicas podem ser ativadas por pulso de antígeno mediante a adição de dois microgramas por mililitro de LPS junto com cem microgramas de ova para uso com linfócitos T purificados de camundongos OT dois, que possuem linfócitos T CD quatro positivos específicos para ova. Se você estiver usando um antígeno diferente, é importante garantir que utilize uma concentração ideal de antígeno para o pulso de suas DCs aqui; o OVA e o LPS são adicionados ao meio primário de forma que a concentração final de LPS será de dois microgramas por mililitro em 20 mililitros, e a de ova será de cem microgramas por mililitro em 20 mililitros.

Aqui está uma fotografia de como se parece uma cultura típica de células dendríticas no dia 10. Nesta fotografia, é possível observar que a morfologia é muito típica de uma célula apresentadora de antígeno. Você deve sempre verificar a porcentagem de células dendríticas positivas para CD11c por citometria de fluxo.

Isso é para garantir que você tenha uma cultura relativamente pura de células dendríticas para uso em seus experimentos. Aqui, utilizamos o sistema Inky da SEN Instruments para monitorar a ativação de células dendríticas que foram tratadas com LPS e pulsadas com antígeno no dia 10. Este vídeo abrange um período de 24 horas imediatamente após a adição de LPS e do peptídeo, durante o qual as células dendríticas tornam-se mais ativas e ocorrem algumas alterações morfológicas evidentes.

Uma vez que suas células dendríticas tenham sido ativadas no pulso de antígeno, você pode coletá-las novamente por meio da incubação com EDTA 300 milimolar e lavagem da placa. Agora, centrifugue suas células, lave-as duas vezes com 50 mL de meio RPMI para remover qualquer antígeno adicional e marque-as com o corante apropriado para rastreamento celular. Neste experimento, estarei realizando a imagem das células no linfonodo inguinal.

Teremos de injetar de dois a cinco milhões de células dendríticas na derme na região do flanco do camundongo mostrado aqui. Em seguida, aguardamos 24 horas para que as células dendríticas migrem para o linfonodo de treinamento. Neste vídeo, as células dendríticas são marcadas com CMF dois hc, um corante azul para rastreamento celular.

É possível observar as células dendríticas interagindo com linfócitos T marcados, específicos para o antígeno volin. Esses linfócitos T estão marcados com ccf SE. Você também pode usar C-M-T-M-R ou qualquer outro corante rastreador celular para sondas moleculares. Esta é a fase inicial de ativação dos linfócitos T interagindo com as DCs.

Como são específicas para o antígeno, é possível observar que as células T estão aderindo aos prolongamentos dos DCs marcados em azul. Isso conclui o nosso protocolo que demonstra o preparo e o uso de células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongo em um experimento de imagem de dois fótons. Obrigado por assistir e boa sorte com os seus próprios experimentos.