Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

A *C. elegans* é um organismo modelo incrivelmente útil devido ao nosso conhecimento sobre suas linhagens celulares, bem como à grande quantidade de informações obtidas a partir do sequenciamento e análise de todo o seu genoma. Neste vídeo, demonstramos o processo de microinjeção de plasmídeos na *C. elegans* e a seleção de descendentes transgênicos utilizando microscopia de fluorescência. Sendo um animal transparente e multicelular, a *C. elegans* é ideal para visualizar transgenes que expressam proteínas marcadas com fluorescência *in vivo*. Olá, meu nome é Laura Berkowitz e sou pesquisadora associada no Laboratório Caldwell, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama.

E eu sou Adam Knight, também do Laboratório Calwell na Universidade do Alabama. Hoje vou mostrar a vocês como se preparar e realizar a microinjeção de plasmina para gerar linhagens transgênicas de *C. elegans*, e também como selecionar e manter linhagens transgênicas de *C. elegans*. Então, vamos começar.

Antes de iniciarmos a microinjeção, temos algumas etapas de preparação, que mostrarei agora. Primeiro, prepare o DNA plasmidial a ser injetado; são necessários dois plasmídeos, um que codifica a expressão tecido-específica do nosso gene de interesse e o segundo que fornece um marcador de transformação selecionável. Misture os plasmídeos em uma proporção de um para um, de 50 nanogramas por microlitro.

A seguir, prepare os suportes de parafuso helicoidal, que serão usados para imobilizar os vermes durante a injeção. Para fabricar os suportes de parafuso helicoidal, coloque inicialmente várias lamínulas de 22 por 50 milímetros sobre a bancada. Usando uma pipeta de Pasteur, coloque uma gota de ágar a 2% derretido sobre uma lamínula e, imediatamente, posicione uma segunda lamínula sobre a gota em um ângulo de 90 graus em relação à primeira.

Deixe o aero solidificar por alguns segundos e, em seguida, remova a lamínula superior. O diâmetro do disco achatado de aero deve estar entre 15 e 20 milímetros. Como se fosse um animal de estimação, deixe a plaqueta secar ao ar completamente por várias horas ou durante a noite.

Uma vez secos, armazene as lâminas em uma caixa de vidro de relógio à temperatura ambiente. Em seguida, prepare os carregadores de agulha para a solução de DNA. Para isso, pegue um tubo capilar de cem microlitros e aqueça-o no meio de uma chama aberta, puxando-o rapidamente até aproximadamente o dobro do seu comprimento original.

Após o tubo capilar esfriar, quebre as duas metades separando-as. Estoque de 10 a 20 carregadores de agulha para injeção. Você pode armazená-los na posição vertical em um tubo de microcentrífuga.

Brack, tenha cuidado. As pontas do carregador de agulhas são muito afiadas. Agora, prepare as microagulhas de injeção.

Essas agulhas são feitas a partir de um tubo capilar especial que contém um filamento interno de vidro. Esse filamento atua como um pavio para a solução de DNA. Para fabricar as agulhas, utilizamos um puxador Niki PP eight 30 Polar com um ajuste de calor de 24,8, puxando várias agulhas de cada vez para armazenamento.

Vários agulhas podem ser montadas em uma tira de massa de modelar. Pequenos fragmentos de lamínula serão usados para romper a ponta da agulha puxada. Esses fragmentos são preparados envolvendo uma lamínula de 18 por 18 milímetros em um lenço de papel Kim e aplicando suavemente pressão até que se quebre em várias partes.

Utilize fragmentos com aproximadamente três por quatro milímetros de tamanho. Além de preparar o DNA e as agulhas, prepare cerca de 50 a 100 vermes adequadamente estagiados. Dois vermes do tipo selvagem para cada construto de vetor de expressão a ser injetado.

Agora estamos prontos para configurar o microscópio de microinjeção. Para começar a montagem do microscópio, abra a válvula principal do tanque de hélio conectado ao braço e suporte da agulha de microinjeção. Feche o regulador para permitir que o gás entre na tubulação.

Levando a pressão a 35 PSI, o gás pode ser liberado usando um pedal. Em seguida, insira um carregador de agulha em um tubo de pipetador bucal padrão e coloque uma pequena quantidade da mistura de plasmídeo, aproximadamente um microlitro. Agora, insira suavemente o carregador completamente através da agulha de microinjeção até sentir resistência.

Expulse a solução de DNA soprando suavemente e, em seguida, remova o carregador. Uma vez que o DNA esteja carregado, insira a agulha no braço de microinjeção, tomando cuidado para posicioná-la dentro da pequena junta de borracha interna e, então, fixe-a ao braço do manipulador. Em seguida, coloque um fragmento de vidro de cobertura para quebrar agulhas em uma borda do suporte de rosca.

Cubra o fragmento, bem como toda a superfície do suporte de auga, com óleo de carbono vazio. Em seguida, coloque o suporte de auga sobre a platina de um microscópio invertido. Depois que o suporte estiver posicionado, posicione a agulha no centro do campo de visão utilizando o objetivo Forex e a iluminação de campo claro, mas ainda não a abaixe até o óleo.

Em seguida, posicione a borda interna do fragmento de lamínula no centro e, então, foque nela. Abaixe a agulha no óleo, trazendo-a para o mesmo plano de foco do fragmento de lamínula. Aumente a magnificação trocando para a objetiva de 40 x, refocuse na borda do fragmento e reposicione a ponta da agulha, se necessário.

Agora, quebre a ponta da agulha de injeção. Empurre suavemente a agulha contra a borda do fragmento de lamínula, ao mesmo tempo em que aplica um breve pulso de gás por meio do pedal. A ponta da agulha será aberta adequadamente.

Quando pequenas gotas de líquido escapam da ponta da agulha devido a um orifício excessivamente grande, o fluxo excessivo de líquido não é desejável, pois matará os animais. Uma vez que a agulha estiver pronta, iniciamos a microinjeção. Em seguida, remova o suporte de fixação do estágio elevando a agulha para cima.

Mas não altere a posição dos eixos X ou Y. Deslize a platina para fora de sob a agulha. Remova o suporte da broca e coloque-o sobre um microscópio estereoscópico.

Transfira um verme para a placa situada abaixo da superfície do óleo. Se o verme se contorcer suavemente, toque-o levemente até que entre em contato com a placa de agar, momento em que o verme úmido deverá aderir ao agar seco. Coloque rapidamente a placa de agar de volta sobre a platina, centralizando o verme no campo de visão.

Em seguida, abaixe a agulha até o mesmo plano de foco do verme. Altere os filtros no microscópio invertido para iluminação Hoffman. Esse filtro de contraste permite que os detalhes morfológicos do verme se tornem visíveis.

Usando a objetiva de 40 x, foque no centro sensorial granulado da gônada do verme abaixo do padrão em favo de mel dos núcleos germinativos. Escolha a gônada que estiver posicionada no lado do verme voltado para a agulha. Ajuste cuidadosamente a posição da agulha até que a ponta também esteja em foco.

Insira suavemente a agulha no centro da gônada e aplique um breve pulso de pressão de gás para expelir uma ou duas gotas de DNA no braço da gônada. Você deve observar uma onda de líquido se espalhando pela gônada distal com muita prática e habilidade. Você pode atingir o centro da gônada todas as vezes.

É importante lembrar que é necessário trabalhar rapidamente ao injetar um verme, pois ele pode desidratar-se facilmente. Todo o processo deve levar idealmente menos de um a dois minutos.

Após a conclusão da injeção, remova o suporte do parafuso sem-fim do estágio e coloque-o em um microscópio estereoscópico. Adicione um microlitro de tampão M nove diretamente sobre o verme injetado. Isso pode exigir submergir a ponta da pipeta abaixo da superfície do óleo halo carb.

O tampão deve reidratar o verme e, em seguida, ele flutuará na superfície do disco de aeros, transfira o verme para uma placa comum usando um palito para vermes. Agora vou entregar os vermes injetados ao Adam e ele nos mostrará a seleção e a manutenção das linhagens transgênicas. Os vermes injetados são transferidos para placas individuais de 60 milímetros, recém-semeadas, e deixados para se reproduzirem.

Essas minhocas representam a geração P zero. Normalmente, os animais injetados são incubados a 20 graus Celsius por dois a três dias, até que a prole apareça. Assim que a prole surgir, estamos prontos para iniciar a triagem de minhocas transgênicas.

A prole F1 é observada em busca de evidências do marcador transgênico. Neste caso, o marcador selecionável é fluorescente, portanto podemos realizar a triagem utilizando um microscópio estereoscópico de fluorescência. Cada animal F1 portador do marcador fluorescente é clonado separadamente em uma nova placa.

O P zero injetado pode produzir apenas uma a cinco proles fluorescentes entre todos os seus F1. Deixe as hermafroditas F1 se reproduzirem a 20 graus por dois a três dias, até que a prole apareça. Quando a geração F2 estiver pronta, ela também é observada quanto a animais transgênicos. Animais F2 que herdaram e expressaram um marcador transgênico são considerados uma linhagem estável.

Cada linhagem estável independente deve ser mantida como uma linhagem separada; propague cada linhagem transferindo vários animais transgênicos para uma nova placa a cada geração. Isso deve ser realizado utilizando um microscópio estereoscópico com fluorescência. Se o marcador selecionável for fluorescente, para controlar a variabilidade no número de cópias do gene, gere no mínimo três linhagens estáveis independentes por construto injetado.

Acabamos de mostrar como microinjetar expressão, construtos de vetor e elgan e como selecionar linhagens estáveis. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.