Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes
18 de julho de 2008
Este vídeo demonstra como usar C. elegans para avaliar neurônio dopaminérgico neurodegeneração como um modelo para a doença de Parkinson. Além disso, as telas genéticos são usados para identificar os fatores que quer aumentar a degeneração ou neuroprotetor.
No Laboratório Caldwell, também conhecido como Worm Shack, estudamos os mecanismos das doenças neurológicas em Caenorhabditis elegans. E após um longo dia de experimentação produtiva, recompensamo-nos com alguma atividade recreativa. Olá, sou Adam Knight, aluno de graduação do Laboratório Calwell, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama.
Hoje, eu e outros mostraremos como realizar um ensaio de degeneração de neurônios dopaminérgicos em C. elegans. Realizarei o cruzamento de uma linhagem de vermes com neurodegeneração dopaminérgica com linhagens transgênicas que superexpressam genes candidatos relacionados à doença e neurônios dopaminérgicos. Olá, sou Adam Harrington, aluno de pós-graduação no Laboratório Caldwell.
Hoje vou mostrar a você como preparar os vermes transgênicos para análise de neurônios dopaminérgicos. Olá, sou Shu Amichi e sou estudante de pós-graduação. Aqui, vou mostrar a você como analisar seus neurônios dopaminérgicos de C. elegans, que são chamados de ceps e aides.
De modo geral, os vermes que expressam apenas GFP nos neurônios dopaminérgicos não apresentam morte celular. No entanto, na presença de CLE, você observará neurodegeneração dependente da idade. Utilizando este ensaio, um transgene pode ser coexpressado nos neurônios dopaminérgicos para determinar se ele pode potencializar ou suprimir a toxicidade induzida por CLE. Então, vamos começar.
Antes de realizar a análise dos neurônios dopaminérgicos, devemos primeiramente cruzar as linhagens GaN apropriadas para colocar oito exemplares expressando tanto o nucleoalfa quanto GFP sob o controle do promotor específico de neurônios dopaminérgicos dat-1 em uma placa de cruzamento. Agora, adicione dois estágios L4 de cães transgênicos hermafroditas que exibem expressão específica de neurônios dopaminérgicos do nosso gene de interesse candidato, bem como expressão nas células do músculo da parede corporal do marcador fluorescente selecionável DS-Red2. É importante observar que, para cada construto transgênico, geramos três linhagens transgênicas estáveis.
Portanto, esse cruzamento genético deve ser realizado individualmente para cada uma das três linhagens estáveis separadas criadas. Após dois dias, remova e descarte os machos após mais dois a três dias. Inspecione a geração F1.
Há vários descendentes machos e o acasalamento foi bem-sucedido. Em seguida, transfira individualmente para novas placas cinco animais L4 de Afrodite de cada cruzamento que exibam tanto o marcador fluorescente GFP herdado do progenitor macho quanto o marcador DS vermelho de dois pontos na parede muscular do corpo herdado do progenitor hamadi. Os animais transferidos precisam estar no estágio L4 para garantir que ainda não tenham sofrido M it.
Com os animais machos presentes na placa, permita que os animais se autofertilizem por três a quatro dias para produzir a prole F2. Agora, remova a prole F2 para fazer isso. Transfira cinco a 10 animais que exibem ambos os marcadores cent para placas individuais separadas.
Em seguida, examine a geração F3 em placas nas quais cem por cento dos animais expressam GFP em neurônios dopaminérgicos e nos quais alguns dos animais expressam o marcador fluorescente DS Red dois em células musculares da parede corporal. Esses animais serão homozigotos para os genes alfa-sinucleína e GFP e também transmitirão de forma estável o transgene recém-criado. Após a conclusão da triagem, estamos prontos para realizar a análise dos neurônios dopaminérgicos.
Para iniciar a análise dos neurônios, prepare uma placa fresca com os três animais transgênicos identificados na etapa anterior. Monte uma placa para cada uma das três linhagens transgênicas. Além disso, plaque a linhagem que expressa apenas a alfa-sinucleína GFP como controle e permita que os vermes cresçam até a fase adulta.
Uma vez que os vermes tenham atingido a fase adulta, transfira de 30 a 40 animais transgênicos de cada linhagem para uma placa fresca. Deixe-os depositar ovos por cinco horas a 20 graus Celsius. Após cinco horas, remova e descarte os animais.
Os adultos permitem que os embriões se desenvolvam por três a quatro dias a 20 graus Celsius até atingirem o estágio L4. Em seguida, selecione cerca de cem animais transgênicos no estágio L4 para uma placa contendo 0,04 miligramas por mililitro de cinco fluoro-2-desoxiuridina.
Este análogo de nucleotídeo impede o desenvolvimento da próxima geração por meio da inibição da síntese de DNA. Como as placas de FDUR são sensíveis à luz, proteja-as da luz mantendo-as cobertas e completamente embrulhadas. Prepare um pad gross para a análise do verme.
Estes são usados frescos e não devem secar. Prepare dois lâminas de microscópio com um pedaço de fita adesiva atravessada sobre elas no sentido longitudinal. A fita serve como espaçador para obter almofadas de espessura equivalente.
Coloque uma terceira lâmina entre elas sobre a bancada. Elas estão posicionadas. Três lado a lado.
Coloque uma gota de arus fundido no lado central e coloque rapidamente outro lâmina por cima do agros perpendicularmente a duas e sobre todas as três lâminas. Repita para fazer várias almofadas adicionais, tantas quantas forem necessárias para o número de amostras a ser analisado. Uma vez que as almofadas de auger estejam prontas, coloque uma gota de seis microlitros de anestésico de 3 milimolar, 11 mile saw, sobre um lamínula de 22 por 30 milímetros.
Coloque 40 animais adultos na gota e, em seguida, inverta o cubre-objeto sobre o suporte de ágar. Repita para cada uma das outras linhagens. Avalie 30 animais por linhagem quanto à presença de cada CEP e de um neurônio D.
Utilizando um microscópio composto com fluorescência epiluminescente e um cubo de filtros que permita a visualização de FITC ou GFP, usaremos um cubo de filtros endo G-F-P-H-Y-Q para registrar os dados em uma planilha de pontuação. Animais selvagens retêm GFP completo nas aulas em todos os quatro neurônios CEP e dois neurônios ADE. Indivíduos que exibem perda dos neurônios D são classificados como selvagens conhecidos ou degenerativos.
Esses neurônios são registrados como LG ou perda de GFP. Da mesma forma, o grau de degeneração pode ser pontuado contando-se o número total de neurônios perdidos em cada animal, além de a população repetir a análise mais duas vezes. Utilizando mais 30 animais por linhagem por ensaio.
O número total de vermes que exibem neurônios dopaminérgicos do tipo selvagem nas três rodadas de análise é média. A análise estatística para neuroproteção é então realizada utilizando o valor P do teste t de Student inferior a 0,05. Para comparar vermes controle com linhagens que superexpressam genes candidatos em neurônios dopaminérgicos, realize esta análise em diversos dias após a deposição de ovos; os dias apropriados de análise são determinados empiricamente.
Por exemplo, determinamos que 77%87% e 90% dos animais alfa CLE mais GFP exibem neurônios dopaminérgicos degenerados no sexto, sétimo e décimo dia após o desenvolvimento, respectivamente. Portanto, se previrmos que o transgene de interesse possa acentuar a neurodegeneração, analisaremos no sexto dia. Da mesma forma, o transgene que possa suprimir a neurodegeneração será analisado no sétimo e décimo dia.
Acabamos de mostrar como realizar um ensaio de neurodegeneração dopaminérgica em *C. elegans*. Ao conduzir este procedimento, é importante lembrar-se de: primeiro, utilizar o marcador apropriado para seleção durante os cruzamentos genéticos; segundo, utilizar machos saudáveis e fêmeas L4 para os cruzamentos.
E três, certifique-se de pontuar cuidadosa e consistentemente os neurônios CEP e DE. Este procedimento permitirá que você realize rapidamente ensaios para fatores genéticos que possam potencializar ou suprimir a neurodegeneração induzida por CLE alfa alfa. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra como usar C. elegans para avaliar a neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos como modelo para a doença de Parkinson. Telas genéticas são utilizadas para identificar fatores que ou potencializam a degeneração ou são neuroprotetores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurodegeneração
- Genética
Antecedentes
- C. elegans atua como organismo modelo para o estudo de doenças neurológicas.
- Os neurônios dopaminérgicos são fundamentais para compreender a doença de Parkinson.
- A manipulação genética pode revelar fatores neuroprotetores.
- Ensaios podem avaliar o impacto de diversos genes na saúde dos neurônios.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a degeneração de neurônios dopaminérgicos em C. elegans.
- Identificar fatores genéticos que influenciam a neurodegeneração.
- Explorar possíveis mecanismos neuroprotetores.
Métodos Utilizados
- Cruzamento de linhagens de vermes com neurodegeneração dopaminérgica com linhagens transgênicas.
- Realização de ensaios de degeneração para avaliar a saúde dos neurônios.
- Utilização de telas genéticas para identificar genes candidatos.
- Análise dos efeitos de genes superexpressos sobre a degeneração neuronal.
Resultados Principais
- Demonstrou a utilidade de C. elegans no estudo da doença de Parkinson.
- Identificou diversos fatores genéticos que influenciam a degeneração neuronal.
- Mostrou efeitos neuroprotetores potenciais de certos genes.
- Forneceu insights sobre os mecanismos de neurodegeneração.
Conclusões
- C. elegans é um modelo eficaz para investigar a saúde dos neurônios dopaminérgicos.
- Telas genéticas podem revelar informações importantes sobre processos neurodegenerativos.
- Estudos futuros podem levar a novos alvos terapêuticos para a doença de Parkinson.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A validação de genes candidatos na doença de Parkinson exige sistemas de modelo robustos e preditivos que permitam a desmistificação mecanicista no início do processo de descoberta. O ensaio de degeneração de neurônios dopaminérgicos em C. elegans fornece uma plataforma quantitativa e geneticamente manipulável para validação funcional e priorização de alvos. Esta abordagem auxilia na triagem de portfólios ao distinguir moduladores com potencial translacional de leads mecanicamente ambíguos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação funcional de genes candidatos à doença de Parkinson em um sistema vivo e geneticamente definido.
- Apóia a desmistificação mecanicista mediante a medição direta de fenótipos de neurodegeneração associados à expressão humana de alfa-sinucleína.
- Facilita a triagem rápida de listas de genes provenientes de estudos de associação genética por meio de validação in vivo.
- Oferece confiabilidade preditiva para avançar alvos gênicos em modelos de ordem superior.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma leitura quantitativa e reprodutível da sobrevivência de neurônios dopaminérgicos utilizando marcadores GFP.
- Padroniza a avaliação da neurodegeneração em múltiplas linhagens transgênicas estáveis e réplicas.
- Permite a avaliação escalonável dos efeitos da superexpressão ou supressão gênica sobre a toxicidade da alfa-sinucleína.
- Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem de compostos ou genética downstream.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a mecanismos relevantes para a doença ao modelar a neurodegeneração induzida por alfa-sinucleína.
- Permite a continuidade da descoberta genética até a validação pré-clínica de fatores neuroprotetores ou patogênicos.
- Oferece uma plataforma para validação cruzada de alvos entre espécies, incluindo a tradução de resultados de triagens genéticas em levedura.
- Subsidiar o avanço dos alvos genéticos com base em dados de neuroproteção ou toxicidade in vivo, ajustados ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio conecta a descoberta genética inicial e a validação pré-clínica ao permitir testes orientados por hipóteses de genes candidatos em um modelo animal vivo. Ele suporta fluxos de trabalho desde a identificação de alvos até a priorização de compostos líderes e a redução de riscos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Facilita o teste da hipótese nula para a função gênica em vias de neurodegeneração.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas para comparar os efeitos gênicos na sobrevivência de neurônios.
- Análises: Utiliza análise estatística (teste t de Student, p<0,05) para determinar a significância da neuroproteção ou toxicidade.
- Pesquisa Translacional: Valida descobertas genéticas entre espécies e alinha-se com fenótipos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e escalonável para esforços contínuos de validação gênica e de vias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Fornece ensaios in vivo padronizados, reprodutíveis e escalonáveis para validação gênica.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos genéticos em programas para doenças neurodegenerativas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em genética de C. elegans, transgênese e microscopia de fluorescência.
- Exige acesso a equipamentos de microinjeção, microscópios compostos e conjuntos de filtros para fluorescência.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de análise e análise estatística.
- A adaptação a outros modelos de doenças neurodegenerativas pode exigir otimização de promotores ou marcadores.
- O rendimento é limitado pela pontuação manual e pela geração de linhagens transgênicas estáveis.
