Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Olá, sou Randall Hoffman, aluno de pós-graduação no Laboratório de Susan Linus, do departamento de biologia do MIT. Hoje vou apresentar a vocês a eletroforese em gel com detergente semidesnaturante, ou SDD age. Nosso laboratório utiliza essa técnica para triagem de príons e outras proteínas alogênicas.

Nossa versão da idade SDD é simples e confiável e pode ser ampliada para acomodar qualquer número de amostras. As amiloides são excepcionalmente resistentes à desnaturação por SDS, o que permite que sejam separadas de outras proteínas utilizando SDDH. No entanto, os dados obtidos por SDDH não podem, por si só, ser usados para confirmar que algo é amiloide.

Para fazer isso, você precisa usar outras técnicas. Tendo isso em mente, deixe-me mostrar. A sequência S-D-D-H-S-D-D-H pode ser realizada usando equipamento padrão para eletroforese horizontal de DNA.

Primeiro, você precisa montar a bandeja de moldagem do gel. O tamanho do aparelho dependerá da quantidade de amostras que você possui. Para um grande número de amostras, utilizamos uma placa de 20 por 24 centímetros e até quatro pentes de 50 poços.

Para preparar o gel, você precisará de agarose de baixa EEO com força média ou alta, tampão 1xTAE e uma solução estoque a 10% de SDS. Prepare uma solução a 1,5% de agarose e 1xTAE. É recomendável fazer o gel o mais espesso possível para poder carregar a maior quantidade de amostra e maximizar a detecção. Aqueça a mistura no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida.

Adicione rapidamente o estoque de SDS 100 X a 0,1% e gire para misturar. Se parte do ágar se solidificar durante este passo, aqueça para dissolvê-lo em uma placa aquecedora. Tenha cuidado para não deixar ferver.

Após adicionar SDS, como a solução pode facilmente transbordar com bolhas, despeje-a na bandeja de moldagem enquanto ainda estiver quente. Em seguida, use um pente para remover quaisquer bolhas que possam interferir posteriormente durante a transferência do gel. Depois que o gel estiver completamente resfriado e solidificado, remova cuidadosamente os pentes e coloque o gel no tanque.

Imersa completamente o gel em um XTAE com SDS 0,1%. Agora você está pronto para carregar suas amostras. As amostras proteicas utilizadas na SDDH são preparadas da mesma forma que em uma eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, com duas exceções importantes.

Primeiro, você deve evitar o aquecimento das amostras, o que poderia desnaturar os agregados em monômeros proteicos. Segundo, tenha cuidado para evitar a degradação proteica. Como as condições desnaturantes utilizadas aqui não são suficientes para inativar todas as proteases, recomendamos o uso de pelo menos o dobro da concentração recomendada de um coquetel completo de inibidores de protease.

Nesta demonstração, usaremos lisados de células de levedura que superexpressam uma proteína específica de interesse. Geralmente, utilizamos dois mililitros de culturas cultivadas durante a noite em blocos de 96 poços disponíveis pela VWR, mas ao analisar proteínas de baixa abundância, devem ser usados volumes maiores de cultura.

Recolha as células por centrifugação do cultivo a 2000 RCF durante cinco minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, remova o sobrenadante e lave as células ressuspendendo-as em água e centrifugando novamente. Após a segunda centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em solução de plaqueamento fresca. A zimase na solução digere as paredes celulares, o que permitirá lisar eficientemente as células em um pequeno volume de tampão de lise. Incube por 30 minutos a 30 graus Celsius.

Centrifugue as células plásticas excedentes desta vez a 800 RCF durante cinco minutos. Remova completamente o sobrenadante e re-suspenda cada pellet em 100 microlitros de tampão de lise. Em seguida, cubra o bloco com fita adesiva e vortexe em alta velocidade por dois minutos.

Isso ajuda todos os plásticos das esferas a lisar as células e remover os detritos celulares a 4.000 RCF durante dois minutos. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para uma placa PCR de 96 poços.

Tipicamente, analisamos centenas de amostras ao mesmo tempo em nosso laboratório, por isso, para nos auxiliar nessa tarefa, utilizamos um sistema de manipulação de líquidos. Se desejar, determine a concentração proteica dos lisados. Em seguida, adicione tampão de amostra quatro x às amostras para gerar lisados contendo tampão de amostra um x e incube por cinco minutos à temperatura ambiente.

Agora, carregue as amostras no gel. Se desejar, reserve metade das amostras para análise em SDS-PAGE. Além disso, carregue marcadores de peso molecular, incluindo marcadores pré-coloridos e um marcador de peso molecular muito alto, como o extrato de flector de frango.

Se desejar, é importante manter o gel frio para evitar a difusão de proteínas de baixo peso molecular, portanto você pode querer executá-lo em câmara fria. Execute o gel em baixa voltagem, inferior a três volts por centímetro de comprimento do gel. Execute o gel por várias horas até que o corante alcance cerca de um centímetro do final do gel.

Como o amiloide não é desnaturado por SDS a 2% em temperatura ambiente, ele permanecerá intacto enquanto outros complexos, incluindo a maioria dos agregados não amiloides, se dissociam na presença de SDS a 2%. Assim, a maioria das proteínas estará na forma monomérica e migrará rapidamente através do gel. Já os amiloides de alto peso molecular resistentes ao SDS migrarão mais lentamente.

Após isso, o gel estará pronto para a transferência. Embora vários métodos de transferência possam ser utilizados, obtemos os melhores resultados usando a transferência por capilaridade. Como a transferência por capilaridade pode acomodar géis de qualquer tamanho, é prático analisar centenas de amostras por meio da transferência por capilaridade.

Uma pilha de papéis absorventes secos atua removendo o tampão através do gel, depositando proteínas em uma membrana de nitrocelulose colocada entre os papéis e o gel. Você precisará cortar um pedaço de nitrocelulose, como a High Bond C, extra, com as mesmas dimensões do gel. Você também precisará cortar 20 pedaços de papel absorvente GBO oh quatro e oito pedaços de papel absorvente GBO oh dois com o mesmo tamanho do gel.

O GB oh quatro é muito grosso e absorvente. Já o GBO oh dois é muito mais fino e possui uma textura mais suave, o que garante um contato mais uniforme com a membrana. Corte um pedaço adicional de GBO oh quatro para ser usado como pavio e faça com que ele tenha cerca de 20 centímetros a mais de largura do que o gel imerso.

O UL nitroso WIC e quatro pedaços de GBO oh dois e um XTBS em um recipiente plástico montam uma pilha de papéis da seguinte forma: 20 pedaços de GBO oh quatro secos. Depois, quatro pedaços de GBO oh dois secos. Em seguida, um pedaço de GBO oh dois pré-umedecido.

Coloque a nitrocelulose sobre esta pilha. Enxágue brevemente o gel na bandeja de moldagem com água para remover o excesso de tampão de eletroforese. Em seguida, comece cuidadosamente a deslizar o gel para fora da bandeja sobre a pilha, deslocando o gel da bandeja para baixo a membrana com TBS conforme necessário.

O tampão extra ajuda a evitar que bolhas fiquem presas no gel. A pipeta de transferência funciona bem para esse fim após o gel ter sido completamente movido para a pilha. Verifique cuidadosamente a presença de bolhas, caso haja alguma.

Levante a borda do gel e reaplique o tampão até que as bolhas possam ser removidas. Coloque as três peças restantes de GBO oh dois previamente umedecidas sobre o gel. Garanta um contato completo entre todas as camadas rolando firmemente uma pipeta sobre a parte superior da pilha.

Coloque duas bandejas elevadas contendo TBS ao lado da pilha de transferência e estenda o pavio pré-umedecido sobre a pilha, de modo que ambas as extremidades do pavio fiquem submersas no TBS. Cubra a pilha de transferência montada com uma bandeja plástica adicional que tenha peso extra, como uma garrafa de 500 mL de água. O pavio irá puxar o tampão das bandejas e os papéis de blotting secos irão drenar o tampão através do gel ao longo de várias horas.

Isso depositará as proteínas na membrana; permita que a transferência prossiga por um mínimo de três horas ou durante a noite. Após a conclusão da transferência por capilaridade, a membrana pode ser processada por meio de um western blot padrão. Aqui você vê uma imagem típica de proteínas que foram superexpressas em uma linhagem de levedura que predispõe certas proteínas a formar amiloides.

É possível observar claramente que alguns dos nossos candidatos formam espécies resistentes à SDS de alto peso molecular ou amiloides muito bem, como os mostrados aqui e aqui. Outros, no entanto, não formam agregados e são completamente monoméricos, como estes e estes. Além disso, é possível observar que o tamanho dos polímeros amiloides varia conforme a proteína, o que pode ser visto nestas duas faixas.

Acabamos de mostrar um método simples para analisar agregados de alto peso molecular e insolúveis, como amiloides de prions candidatos. Esperamos que tenham apreciado a nossa apresentação e que estejam achando esta técnica útil para estudos de proteínas imunogênicas de Amy. Obrigado por assistir e boa sorte em suas pesquisas.