Imunoprecipitação DNA metilado

Este vídeo demonstra um protocolo para imunoprecipitação de DNA metilado ou meetup. Um método utilizado para isolar especificamente DNA metilado de maneira imparcial. A metilação de DNA em mamíferos é caracterizada pela adição de um grupo metila à posição C5 da citosina.

Quando presente em um dinucleotídeo CPG, trata-se de uma marca epigenética reversível que desempenha um papel importante no desenvolvimento normal, bem como em diversos processos de doenças. As funções normais da metilação do DNA incluem a inativação do cromossomo X em fêmeas, o silenciamento de elementos repetitivos, a impressão genômica e a manutenção da estabilidade genômica. A metilação do DNA também demonstrou desempenhar um papel em inúmeras doenças, como câncer, síndrome de Prader-Willi, síndrome de ICF (imunodeficiência, instabilidade centromérica e anomalias faciais) e síndrome de Rett.

Em cânceres, por exemplo, a hipermetilação anormal e os promotores podem resultar no silenciamento de genes vitais supressores de tumor. Enquanto a hipometilação inadequada resulta em instabilidade cromossômica e ativação de oncogenes, a reunião é realizada primeiramente pela sonicação do DNA em fragmentos com tamanhos variando de 300 a 1000 pares de bases. O DNA sonicado é então desnaturado a 95 graus Celsius.

Acrescentam-se anticorpos primários, que reconhecem a pentametazina, e permite-se que se liguem a fragmentos de DNA metilado. Anticorpos secundários, conjugados a microesferas magnéticas Dyna, são utilizados para isolar fragmentos de DNA que foram ligados pelo anticorpo primário. Os fragmentos não metilados são removidos e os anticorpos são digeridos pela proteinase.

A limpeza com fenil cloroformo KA remove a proteína digerida e a precipitação purifica o DNA, que agora está enriquecido em fragmentos metilados. O DNA pode ser usado em aplicações como PCR, microarranjo e sequenciamento. O procedimento é geralmente realizado em dois dias.

O dia um envolve a preparação do DNA, sonicação, imunoprecipitação e digestão proteica. O dia dois envolve extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol para purificar e isolar o DNA enriquecido para metilação. Existem alguns materiais especiais necessários para o procedimento, incluindo tubos de centrífuga silanizados, um dispositivo de sonicação de DNA, anticorpo primário, anticorpo monoclonal anti-5-metilcitosina de camundongo, anticorpo secundário, beads Dyna conjugados com anticorpo de ovelha anti-IgG de camundongo e um suporte magnético para tubos.

O primeiro passo no protocolo Meetup é o preparo do DNA. É fundamental avaliar a natureza do DNA previamente. Conhecer o estado do DNA da amostra, se é predominantemente de fita dupla ou fita simples, é necessário, pois a quantificação precisa da amostra é de extrema importância, e diversos métodos de determinação da quantidade de DNA podem ser negativamente afetados pela presença de espécies indesejadas de DNA.

A quantidade de DNA de dupla fita pode ser avaliada facilmente por fotometria espectral utilizando um NanoDrop 3, 300 nd carregue 1,5 microlitros e defina o tipo de medição como ácido nucleico, selecione DNA 50 como o cálculo e inicialize o instrumento com 1,5 microlitros de água. Limpe os pedestais e faça a leitura de branco com 1,5 microlitros do líquido. A amostra é dissolvida em limpe os pedestais, carregue 1,5 microlitros da amostra e pressione medir.

A concentração será fornecida e pode ser utilizada. Para calcular o número de microlitros necessários para mim, mergulhe um A dois 60 a dois 80 com uma razão de 1,8, o que é ideal aqui. Uma amostra de um micrograma é preparada.

No entanto, uma amostra de apenas 200 nanogramas é suficiente para obter resultados bem-sucedidos. Para reunião, carregue a amostra de DNA em um tubo limpo silanizado. Adicione água estéril suficiente para atingir um volume final de 50 microlitros.

A sonicação do DNA e a imunoprecipitação devem ser realizadas em tubos silanizados para evitar a ligação inespecífica de DNA e proteínas às paredes dos tubos. Uma vez que o DNA tenha sido preparado, a amostra deve ser sonicada; a sonicação é necessária para fragmentar o DNA, pois a imunoprecipitação é mais eficiente com fragmentos menores de DNA. Carregue a amostra no sonicador, certifique-se de que a configuração de potência esteja no nível alto e de que a máquina esteja programada para 30 segundos. Após 30 segundos desligados, encha a base até a linha de marcação com água a quatro graus Celsius.

Sonicar a amostra por sete minutos. Quando a sonicação terminar, retire o tubo e coloque-o em gelo. É importante otimizar as condições de sonicação para o seu tamanho de DNA e amostra previsto previamente.

Por exemplo, uma amostra de DNA parcialmente degradada exigirá um tempo de sonicação mais curto. Os produtos da sonicação podem ser visualizados por técnicas eletroforéticas padrão. Neste momento, são desejados fragmentos de DNA com tamanho variando de 300 a 1000 pares de bases para uso posterior.

Nos ensaios de microarranjo e PCR, você deve reservar um quinto do seu DNA para servir como DNA de entrada ou de referência; neste caso, 800 nanogramas de DNA sonicado serão utilizados para a imunoprecipitação e o restante será reservado como DNA de referência. O próximo passo no protocolo é a reação de imunoprecipitação (IP); antes da adição do anticorpo primário, o DNA deve ser desnaturado. A desnaturação é necessária porque o anticorpo primário é sensível ao DNA de fita simples.

Coloque a amostra em banho-maria a 95 graus Celsius por 10 minutos. Quando a etapa de desnaturação estiver concluída, transfira imediatamente o tubo para gelo por pelo menos cinco minutos. Isso impedirá que o DNA desnaturado se reanilhe e permitirá uma ligação ideal do anticorpo quando a amostra tiver esfriado.

Gire o tubo brevemente para recolher o conteúdo no fundo. Em seguida, deve-se adicionar o anticorpo primário. A quantidade de anticorpo utilizada deve ser titulada para cada lote e para cada fabricante.

Neste caso, adicionamos cinco microgramas de anticorpo primário e, em seguida, adicionamos tampão de imunoprecipitação ou tampão IP até um volume final de 500 microlitros. Em seguida, o DNA de IP é colocado em um rotador e deixado em incubação a quatro graus Celsius por duas horas. A rotação é necessária para evitar a conglobação do anticorpo dentro do tubo durante a incubação.

Aproximadamente 15 minutos antes de concluir a incubação com o anticorpo primário, limpe e prepare as microesferas magnéticas Dyna. Primeiro, ressuspenda completamente as microesferas no frasco por vortexamento. Em seguida, transfira 30 microlitros de microesferas para um tubo limpo silanizado e coloque esse tubo em um suporte magnético para múltiplas reações.

Transfira 30 microlitros de microesferas por reação, mais o suficiente para uma reação adicional para compensar erros de pipetagem ou perda inadvertida de algumas microesferas. Por exemplo, para oito reações, remova microesferas suficientes para nove reações ou 270 microlitros.

As microesferas magnéticas serão atraídas para a parede do suporte magnético. Aguarde dois minutos para que as microesferas migrem e se acomodem em uma faixa definida na parede do tubo. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante com cuidado usando uma pipeta, certificando-se de evitar perturbar as microesferas na parede traseira com a ponteira da pipeta.

Substitua o sobrenadante por um volume em excesso de tampão de IP, agite em vórtex e coloque-o novamente no suporte magnético por dois minutos. Repita essa lavagem mais uma vez e re-suspenda as perlas lavadas em seu volume original de tampão de IP. Retire o tubo de amostra do rotator quando a incubação estiver concluída.

Para concluir a imunoprecipitação, adicione 30 microlitros de microesferas limpas à reação e coloque o tubo de volta no rotador por duas horas a quatro graus Celsius. Durante esta incubação, o anticorpo secundário, que é anti-IgG de camundongo, se ligará ao anticorpo primário de camundongo. Os anticorpos anti-camundongo estão conjugados a microesferas magnéticas Dyna, permitindo a fácil recuperação dos produtos ligados e a etapa de purificação subsequente.

Após a conclusão da incubação com ambos os anticorpos, coloque o tubo de IP no suporte magnético por dois minutos. Neste momento, o DNA metilado estará ligado ao anticorpo primário, que por sua vez estará ligado ao anticorpo secundário conjugado às microesferas magnéticas (dyna beads). Remova e descarte o sobrenadante e substitua por 500 microlitros de tampão de IP.

Misture o conteúdo do tubo e coloque-o novamente no suporte por dois minutos. Repita essa lavagem com o tampão IP mais uma vez. Após a remoção do sobrenadante da última lavagem Resus, suspenda as microesferas pela última vez.

Em 400 microlitros de Tampão de digestão, trate a reação com 100 microgramas de proteinase K e incube durante a noite a 50 graus Celsius. O tratamento com proteinase K é necessário para digerir as proteínas do anticorpo e quaisquer proteínas residuais associadas ao DNA, permitindo que o DNA metilado seja liberado em solução. A purificação de DNA é realizada no segundo dia do procedimento de encontro; retire o tubo de digestão do incubador.

Em uma capela de exaustão, adicione 500 microlitros de fenol-clorofórmio na proporção um para um, com pH sete, ao tubo e homogeneíze completamente por vortex. Centrifugue o tubo por 10 minutos a 13.000 ×g. Remova cuidadosamente a fase aquosa superior do tubo sem perturbar a interface ou retirar qualquer parte da camada orgânica. Transfira a fase aquosa para um novo tubo.

Pode-se realizar uma segunda extração se a interface apresentar aspecto turvo. Em seguida, adicione um décimo do volume de acetato de sódio três molar; neste caso, 40 microlitros. Um microlitro de glicogênio pode ser usado como carreador para facilitar a limpeza do pellet.

Vortexe o tubo para misturar o conteúdo. Em seguida, adicione dois volumes de etanol a 100%, vortexe e congele em freezer a menos 20 graus Celsius por 20 minutos após o congelamento. O DNA precipitado é centrifugado em centrífuga a 13.000 ×g e 4 graus Celsius por 20 minutos.

Um pellet de DNA será formado no fundo do tubo. Retire o tubo da centrífuga e remova o etanol. Tenha cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo.

Pode ser necessário um centrifugamento breve para remover qualquer etanol residual. Para lavar o pellet, adicione 500 microlitros de etanol a 70% frio, vortexie e centrifugue novamente por 20 minutos a 13.000 ×g e 4 °C. Quando a segunda centrifugação estiver concluída, remova o etanol a 70% com um centrifugamento breve e retire o etanol residual com uma pipeta.

Deixe o tubo em um suporte com a tampa aberta para secar o pellet e permitir que o etanol remanescente evapore. Por fim, re-suspenda o pellet contendo apenas DNA enriquecido para metilação em 10 microlitros de água estéril, permitindo tempo suficiente para que o pellet de DNA se dissolva antes do uso. É uma boa prática validar a eficiência do enriquecimento por PCR.

Isso pode ser feito realizando reações de PCR projetadas para amplificar produtos que ilustrem diferencialmente fragmentos de DNA metilados e não metilados com primers de DNA humano normal. A região de controle de impressão H19 pode ser usada em conjunto com primers projetados para amplificar uma região do genoma que não é metilada. Sequências de exemplos de primers e condições de ciclagem de PCR podem ser encontradas no protocolo anexo.

Neste ponto, é necessário recuperar o DNA de entrada ou de referência que foi reservado no início do protocolo de meetup. Um conjunto de reações de PCR será montado utilizando o DNA de entrada, e o outro conjunto utilizará o DNA de IP enriquecido para metilação. Se o meetup foi bem-sucedido, a PCR de IP produzirá um produto utilizando os primers de metilação e nenhum produto utilizando os primers controle.

Por outro lado, a PCR de entrada deve produzir produtos utilizando ambos os primers, pois contém fragmentos metilados e não metilados. Fragmentos de DNA. O DNA enriquecido por fragmentos metilados pode ser usado para diversas aplicações posteriores, como sequenciamento por PCR e análise por microarranjo.

Quando integrada a outras técnicas de biologia molecular, pode ser utilizada para investigar o status de metilação do DNA de forma específica para um locus ou abrangente ao genoma, para perfis de metilação ou estudos de Epigenômica.