Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

Meu nome é Maria e eu trabalho na Y Healthcare em NOS, na Suécia. As proteínas da superfície celular estão frequentemente envolvidas na comunicação entre células e seu ambiente, sendo, portanto, de particular interesse na pesquisa, com o objetivo de obter maior compreensão sobre doenças, bem como outras variações biológicas induzidas por alterações no ambiente celular. Neste vídeo, vou mostrar a vocês um protocolo simples de marcação da superfície celular por método de desvio lateral, permitindo enriquecer visualmente essas proteínas de baixa abundância sem reforço físico e estudar as diferenças dessas proteínas de superfície celular com a tecnologia.

Se você achar essa tecnologia interessante, pode encontrar mais informações no manual 2D. Além disso, temos uma nota de aplicação sobre este tópico específico, que você pode baixar do job. No protocolo de marcação da superfície celular mostrado acima, você marca as células enquanto elas ainda estão intactas. Durante o processo de marcação, o corante terá acesso apenas às proteínas da superfície celular.

Após a etapa de marcação, as células são analisadas para verificar a marcação específica na superfície celular. A amostra marcada foi fracionada em proteínas de membrana e citosólicas. Uma amostra não fracionada foi preparada em paralelo.

Para comparação, esta análise de fracionamento não é necessária, mas foi realizada aqui apenas para demonstrar que o protocolo de superfície celular é específico para as pontas protéicas da superfície celular. Também realizamos o protocolo padrão de marcação sem dieta ETH, conforme mostrado abaixo: as células são lisadas antes da marcação, e dessa forma todas as proteínas celulares ficam acessíveis para marcação. Após a etapa de marcação, as amostras são submetidas à eletroforese bidimensional.

Células aderentes são destacadas utilizando um procedimento não enzimático para evitar a digestão das proteínas de superfície celular alvo. Neste protocolo, utilizamos o raspador de borracha, mas o uso de meio de dissociação celular enzimático também é uma opção. Contamos e dividimos as suspensões celulares em alíquotas de cinco a dez milhões de células por tubo. As células são então centrifugadas e lavadas em H-P-S-S-P-H 7,4 para remover traços de cultura celular.

A contaminação do meio por proteínas séricas e componentes fluorescentes pode interferir na marcação e detecção. Células em crescimento em suspensão são diretamente centrifugadas e lavadas antes da etapa de marcação, após a lavagem. A suspensão celular é ressuspendida em 200 microlitros de tampão de marcação gelado contendo HPSS pH 8,5 e uma molar uréia.

Para condições ideais de marcação de proteínas de superfície celular, verifique sempre o pH. Antes da marcação, utilizamos 600 picomols de side-eye para 10 milhões de células CHO. A proporção ideal de side-eye em relação ao número de células variará conforme o tipo celular.

Como não conhecemos as concentrações exatas das proteínas na superfície celular, como determinar as condições ideais para a marcação lateral de proteínas é descrito no manual de princípios e métodos de eletroforese 2D. As células são incubadas com side eye D floor, dado mínimo, por 20 minutos no gelo e no escuro.

Após a reação de marcação, o corante não reativo é inativado pela adição de 20 microlitros de lisina 10 milimolar. As células marcadas são agora lavadas duas vezes em tampão HPSS pH 7,4 frio para remover o excesso de corante. Assim, não haverá corante livre restante para marcação intracelular indesejada ou proteínas na próxima etapa, que é a lise celular.

As proteínas na superfície celular estão agora marcadas e as células são lavadas e preparadas para serem lisadas. O pellet da última etapa de lavagem é ressuspenso em 150 microlitros de tampão de lise frio contendo sete molar ureia, dois molar tioureia, 4% CHAPS, trinta milimolar Tris, cinco milimolar acetato de magnésio, pH 8,5, e mantido no gelo por pelo menos uma hora com vortexação ocasional. As amostras estão agora prontas para a separação em 2D.

O primeiro passo para a eletroforese é preparar as tiras IPD para a reidratação. Prepare a solução de reidratação específica adicionando o tampão IPG correspondente ao intervalo de pH das tiras utilizadas e adicione a solução na lente da bandeja de reidratação. Remova a película protetora da tira IPG e posicione cuidadosamente as tiras com o gel seco voltado para baixo na bandeja de reidratação contendo a solução de reidratação.

Feche a tampa da caixa IPG e reidrate as tiras durante a noite. Na primeira dimensão, a focalização isoelétrica, as proteínas são separadas de acordo com seu pi. Isso é realizado usando o IPG four three.

As tiras reidratadas são colocadas na placa de aplicação e o eletrodo é montado na parte superior. Foram aplicados 50 microgramas de cada amostra utilizando tampas de aplicação de amostra. Aplicamos diretamente amostras não fracionadas, sem fracionamento prévio, ou fracionamos as amostras em frações membranar e citosólica antes de sua aplicação.

A tampa é fechada para proteger as amostras fluorescentes da luz. O instrumento foi programado de acordo com a recomendação e executado durante a noite. Grandes géis de 12% lamby foram preparados usando o sistema adulto 12 gel.

Adicionou-se solução deslocadora Coster para evitar géis de acrilamida polimerizados nas tubulações. Os géis foram deixados para polimerizar durante a noite à temperatura ambiente antes do uso. Após a focalização isoelétrica, as tiras são removidas e equilibradas em tampão contendo SDS em dois passos, utilizando DTT para reduzir as ligações dissulfeto dos resíduos de cisteína, seguido de alquilação com acetamida para evitar modificações pela acrilamida.

As tiras IPG são mergulhadas no tampão de corrida e cuidadosamente colocadas sobre os grandes géis bidimensionais. Evite aprisionar ar entre as tiras e o gel selando com uma solução fundida de agarose a 2% contendo azul de bromofenol por cima. Os géis estão agora prontos para a separação em segunda dimensão por SDS-PAGE. Na segunda dimensão SDS-PAGE.

As proteínas serão separadas de acordo com o peso molecular e isso é realizado com o sistema tonal six. Preencha a câmara de eletroforese com tampão de corrida anódico, insira os géis e preencha o compartimento superior com tampão de corrida catódico. Conecte a fonte de alimentação conforme as recomendações e realize a segunda dimensão protegida da luz por aproximadamente quatro a cinco horas ou até que a frente do corante alcance a base do gel.

Após a eletroforese em segunda dimensão, as cassetes de gel são posicionadas com o auxílio de pinças no imageador fluorescente Typhoon. Dois géis e três canais podem ser escaneados simultaneamente. O resultado dessa 2DE mostra alta resolução de proteínas de membrana na amostra, mesmo que existam algumas limitações conhecidas para a detecção de proteínas hidrofóbicas em uma 2DE. Os resultados mostram vários novos pontos de marcação na superfície celular, exibidos aqui em vermelho, que não são detectados utilizando o protocolo de marcação padrão mostrado aqui em verde.

Esses resultados mostram que o protocolo de marcação da superfície celular é altamente específico para marcar proteínas de superfície celular. Como as proteínas de superfície celular são marcadas exclusivamente, elas são mais facilmente visualizadas e evita-se a atenuação causada por proteínas citosólicas abundantes. A imagem fluorescente de géis com fração de membrana não fracionada ou fração citosólica é mostrada na parte superior.

Abaixo está uma imagem do mesmo gel após coloração com prata. Os resultados mostram ausência de marcação fluorescente de proteínas citosólicas, mas a coloração com prata demonstra que há proteínas nos géis. Os resultados também mostram padrões semelhantes de mapas de spots nas frações não fracionadas e nas frações de membrana, demonstrando que não há necessidade de fracionamento prévio à eletroforese bidimensional, o que torna este protocolo simples e conveniente.

SI dois, SI três e SCI cinco mostram padrões de marcação semelhantes e são todos compatíveis com o protocolo de superfície celular. Um experimento com dieta foi realizado utilizando os três tipos de meio mínimo side eye DI para estudar a expressão diferencial de proteínas de superfície celular em células CHO submetidas à privação de soro por diferentes períodos de tempo. As amostras de superfície celular CY dois de todas as amostras do experimento foram agrupadas e utilizadas como padrão interno.

As alterações diferenciais de várias proteínas da superfície celular puderam ser acompanhadas durante o período de privação de nutrientes. Mais de 18 proteínas de membrana novas foram detectadas utilizando o protocolo de superfície celular, as quais não foram detectadas com o protocolo padrão para determinar a identidade das proteínas no gel preparativo. Foi necessário adicionar uma alíquota da amostra de superfície celular para facilitar a correspondência com os pontos no conjunto de dados analíticos.

Há resultados. Os resultados mostram uma alta resolução de um grande número de proteínas de superfície celular. Este protocolo é muito específico para proteínas de superfície celular e nenhuma marcação de proteínas intracelulares foi observada.

Com este método, é possível detectar mais proteínas de superfície celular em comparação com um protocolo padrão, e como você já viu, é um protocolo muito simples de executar. Basta marcar suas proteínas de superfície celular enquanto ainda estão intactas e submetê-las diretamente à eletroforese bidimensional, sem fracionamento da membrana. Assim, este é um excelente protocolo para estudar proteínas de superfície celular e as diferenças entre elas com a tecnologia D.