Исследовательская статья

Сравнение результатов анализа ДНК сперматозоидов с использованием различных стратегий гейтинга в потоковой цитометрии

DOI:

10.3791/70417

⸱

10 июля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Reproductive Center, The Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полигональное гейтирование (PGG) и крестообразное гейтирование (CFG) — это методы потоковой цитометрии для определения целостности ДНК сперматозоидов. PGG измеряет индекс фрагментации ДНК (DFI) и высокий индекс окрашивания ДНК (HDS). CFG сообщает о тяжелой форме DFI, лёгкой DFI и общей DFI. Цель данного исследования — сравнить результаты и корреляции между ними.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целостность ДНК сперматозоидов является ключевым фактором для успешного оплодотворения, развития эмбрионов и продолжающейся беременности. Оценка структуры хроматина сперматозоидов (SCSA) с использованием проточной цитометрии после денатурации ДНК и окрашивания в акридиновый оранжевый цвет считается золотым стандартом для оценки ДНК сперматозоидов. В литературе описаны две стратегии гейтинга для оценки индекса фрагментации ДНК сперматозоидов (DFI) на основе цитометрии потока: полигональная гейтинг (PGG) и крестообразная гейтинг (CFG). Целью настоящего исследования было сравнить взаимосвязи результатов анализов между PGG и CFG, а также проанализировать их корреляции с параметрами базового анализа спермы. Данные, полученные независимо с помощью двух методов, сравнивались с помощью статистического анализа, включая графики Бланда-Альтмана и регрессионный анализ. Всего 121 мужчина-амбулаторный пациент, проходивший оценку фертильности в репродуктивном центре нашей больницы, были отобраны с помощью полностью случайного метода выборки. DFI и связанные с ними показатели сперматозоидов были выявлены с помощью проточной цитометрии с использованием PGG и CFG соответственно. Результаты показали, что значения DFI, полученные двумя методами, хорошо согласуются. Коэффициенты корреляции между DFIp по методу PGG и DFIm, DFIs и DFIc по методу CFG составляли соответственно 0,6497, 0,9404 и 0,9667 (все p < 0,01). Высокий индекс окрашивания ДНК (HDS) показал небольшую отрицательную корреляцию с DFI (r = -0,3042, p < 0,05). Процент прогрессивно подвижных сперматозоидов был отрицательно коррелирован с DFIp, DFIs и DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574 соответственно, все p < 0,05). Значимая корреляция между объёмом БДС и спермы, концентрацией сперматозоидов, общим количеством сперматозоидов или PR (%) не наблюдалось. Эти результаты свидетельствуют о том, что DFI более тесно связаны с мужской фертильностью, что говорит о том, что метод CFG, обеспечивающий этот параметр, может быть более подходящим для клинической оценки повреждения ДНК сперматозоидов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целостность ДНК сперматозоидов — это целостность и функциональная стабильность молекулярной структуры ДНК в ядре сперматозоида. В частности, он характеризуется нормальной конформацией хроматина, целостными последовательностями оснований без разрыва или окислительного повреждения, а также способностью точно передавать генетическую информацию потомству. Во время сперматогенеза, когда окисляющий стрессувеличивается 1, ремоделирование хроматинааномально 2 или сперматозоид подвергается воздействию токсиновокружающей среды 3, целостность ДНК сперматозоидов нарушается, что приводит к несоответствию оснований, потере, модификации, добавлению и перекрёстному сшиванию ДНК, разрывам одно- и двухцепочечной и т.д. Кроме того, повреждённая ДНК сперматозоидов может ухудшать мужскую фертильность и негативно влиять на исходы беременности при поддержке репродуктивных технологий (ART)4, а также увеличивать риск повторной потерибеременности 5. В 2021 году Европейская ассоциация урологов (EAU) рекомендовала включить тестирование на DFI в систему оценки мужскойфертильности 6.

В настоящее время целостность ДНК сперматозоидов в основном оценивается с помощью обнаружения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов (DFI). Анализ структуры хроматина сперматозоидов (SCSA) с помощью проточной цитометрии является основным методом оценки DFI7. В литературе описаны два метода цитометрического гейтинга для обнаружения DFI сперматозоидов. Один из них — метод полигонального гейтинга (PGG), который может одновременно сообщать о двух ключевых индикаторах, таких как сперматозоидный DFI иHDS 8. PGG — это классический подход SCSA, характеризующийся меньшим коэффициентом обнаружения вариации и превосходнойповторяемостью 9. Однако он не может определить степень повреждения ДНК. Другой тип — крестообразный гейтинг (CFG), который может фиксировать серьёзный маркер повреждения ДНК сперматозоидов (DFI), лёгкий маркер повреждения ДНК сперматозоидов (DFIm) и общий DFI крестообразного гейтинга метода (DFIc). DFIc равен сумме DFI и DFIm. По сравнению с современными технологиями оценки целостности ДНК сперматозоидов, метод CFG может отражать степень повреждения ДНКсперматозоидов 10.

Чтобы определить, какой метод наиболее подходит для оценки качества сперматозоидов, в этом исследовании использовались как метод PGG, так и метод CFG для измерения DFI и связанных с ними параметров в сперматозоидах. Была сравнивана корреляция между результатами этих двух методов и параметрами традиционного анализа спермы. Насколько нам известно, это первое исследование, анализирующее корреляцию результатов обнаружения между двумя методологиями — PGG и CFG.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Аффилированной больницы Хуайань Медицинского университета Нанкина (номер одобрения: KY-2024-181-01). Информированное согласие было получено от пациентов, чьи образцы использовались в этом исследовании. Общая схематическая схема рабочего процесса, представленная на рисунке 1. Детали используемых реагентов и оборудования изложены в Таблице материалов.

Настройки CFG для потокового цитометра
После кислотной обработки ядерный хроматин сперматозоидов с повреждённой ДНК демонстрирует одноцепочечную ДНК, тогда как ядерный хроматин сперматозоидов с неповреждённой ДНК сохраняет свою целостную двухцепочечную структуру. Флуоресцентный краситель акридино-оранжевый (AO) связывается с одноцепочечной ДНК и при возбуждении лазером 488 нм излучает красную флуоресценцию. Когда он связан с двуцепочечной ДНК, он излучает зелёную флуоресценцию при возбуждении лазером диаметром 488 нм. На основе количества красных и зелёных флуоресцентных сигналов, захваченных потоковым цитометром, рассчитывается отношение красной флуоресценции к общему числу красной и зелёной флуоресценции, что соответствует сперматозоидной DFI.

Настройки CFG были реализованы согласно обзору, предоставленному Янгом и др. 10. Потоковый цитометр должен быть настроен с использованием наименьшей зелёной флуоресценции и самой высокой красной флуоресценции, измеренной в нормальных сперматозоидах, окрашенных в AO, в качестве пограничных ориентиров (рисунок 2). Ниже приведён список характеристик клеток каждого квадранта в CFG:
Квадрант Q1 указывает на нормальные сперматозоиды. Было замечено, что ДНК сперматозоидов осталась целой, а количество связывающего АО минимальным, что приводило к зелёной флуоресценции.
Сперматозоиды в квадранте Q2 имеют частично фрагментированную ДНК и выглядят оранжевыми при флуоресцентной микроскопии. Такая ДНК может быть восстанавливаемой, эти сперматозоиды классифицируются как обладающие лёгкой степенью фрагментации ДНК (DFIm)10.
Квадрант Q3 определяется как неспецифическая флуоресценция, подвергшаяся вычитанию.
Сперматозоиды в квадранте Q4 имеют фрагментированную ДНК и выглядят красными при флуоресцентной микроскопии, что указывает на тяжёлую фрагментацию ДНК (DFI).

Предполагается, что сперматозоиды в квадрантах Q2 и Q4 содержат фрагментированную ДНК, и их сумма определяется как DFIc.

Настройки PGG для потокового цитометра
Многоугольный затвор для цитометрического анализа потока был установлен по методу, описанному Эвенсоном и др. 8. Как показано на рисунке 3, клеточные характеристики, связанные с каждым затвором, следующие:
P3 указывает на процент клеток с денатурированной ДНК.
P4 представляет собой сперматозоиды с высокой окрашиваемостью ДНК (HDS). Эта группа сперматозоидов не имеет нормального обмена гистонов на протамин.
Преобладающие популяции клеток, расположенные вне ворот P3 и P4, состоят из нормальных сперматозоидов, демонстрирующих сниженную красную флуоресценцию и преимущественно излучающие зелёную флуоресценцию.

Сбор и анализ образцов спермы
Все 121 образец спермы были взяты мужчинами, посетившими Репродуктивный центр Первой больницы Хуайаня, аффилированного с Нанкинским медицинским университетом. Образцы спермы собирались путем мастурбации после периода воздержания от 2-7 дней. Рутинный анализ спермы проводился строго в соответствии с требованиями Лабораторного руководства ВОЗ по исследованию и обработке человеческой спермы11,12. Анализ концентрации и подвижности сперматозоидов проводился с помощью компьютерной системы анализа спермы (CASA). Каждый образец анализировался дважды. Результаты были представлены как средние только тогда, когда разница между ними находилась в пределах 95% доверительного интервала; в остальном проводились перевыборка и анализ.

Анализ DFI
Рассчитайте необходимый объём образца для семенной образцы так, чтобы конечная концентрация сперматозоидов в реагенте A из набора проточной цитометрии составляла 2–3 x 106/мл. Метод расчёта: При условии, что концентрация сперматозоидов в исходном образце спермы составляет M x 106/мл, то требуемый объём спермы (μL) = 150/M. Добавьте рассчитанный объём спермы в проточную цитометрическую трубку, затем добавьте 50 мкл реагента A и аккуратно перемешайте. Добавьте 100 мкл реагента B, аккуратно перемешайте и инкубируем 30 секунд при комнатной температуре. Сразу добавьте 300 мкл реагента C и аккуратно перемешайте. Обнажить образец с помощью CFG и PGG на проточном цитометре и проанализировать не менее 5000 сперматозоидов.

Статистический анализ
Данные подвергались статистическому анализу с помощью GraphPad Prism 6.0. Графики Бланда-Альтмана были построены для оценки уровня согласованности между PGG и CFG путём расчёта среднего значения и различий. Различия между двумя методами были отображены по их средним значениям. Кроме того, метод Пирсона был использован для анализа корреляции между PGG и CFG. Было установлено, что p-значение менее 0,05 является статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Среди 121 участника исследования (средний возраст: 32,5 ± 4,9 года; диапазон: 26–44 года) у 28 были диагностированы астенозооспермия и 4 — олигозооспермия. Исходные демографические характеристики и параметры анализа спермы приведены в таблице 1.

Как показано на рисунке 4, график Бланда-Альтмана показал, что результаты DFI сперматозоидов, полученные методами PGG и CFG, демонстрировали отличную согласованность (r = ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6-е издание Лабораторного руководства ВОЗ по исследованию и обработке человеческойспермы 12 рекомендует четыре метода оценки целостности ДНК сперматозоидов: терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (dUTP), маркировка конца (TUNEL), тесты на гелевой электрофорез (Comet), SCSA и тест на дисперсию хроматина сперматозоидов (SCD). Среди них SCSA широко применяется в андрологических лабораториях благодаря использованию потоковой цитометрии для анализа, которая обеспеч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни одного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Компьютерная система анализа спермыBeijing Suijia Software Co., LtdSA-II 
Флоу-цитометр Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., LtdCyto E6
Набор для проведения флоу-цитометрииShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Счетная камера МаклерSefi Medical Instruments
Набор для проверки целостности ДНК ядра спермыShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD-

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vaughan, D. A., Tirado, E., Garcia, D., Datta, V., Sakkas, D. DNA fragmentation of sperm: a radical examination of the contribution of oxidative stress and age in 16 945 semen samples. Hum Reprod. 35 (10), 2188-2196 (2020).
  2. Štiavnická, M., et al. H3K4me2 accompanies chromatin immaturity in human spermatozoa: an epigenetic marker for sperm quality assessment. Syst Biol Reprod Med. 66 (1), 3-11 (2020).
  3. Jeng, H. A., et al. Mixture analysis on associations between semen quality and sperm DNA integrity and occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Arch Environ Occup H. 78 (1), 14-27 (2023).
  4. Li, F., Duan, X., Li, M., Ma, X. Sperm DNA fragmentation index affect pregnancy outcomes and offspring safety in assisted reproductive technology. Sci Rep. 14 (1), 356(2024).
  5. Zhu, X. B., et al. Sperm DNA fragmentation in Chinese couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Asian J Androl. 22 (3), 296-301 (2020).
  6. Minhas, S., et al. European Association of Urology Guidelines on Male Sexual and Reproductive Health: 2021 Update on Male Infertility. Eur Urol. 80 (5), 603-620 (2021).
  7. Agarwal, A., et al. Technical Aspects and Clinical Limitations of Sperm DNA Fragmentation Testing in Male Infertility: A Global Survey, Current Guidelines, and Expert Recommendations. World J Mens Health. 42 (1), 202-215 (2023).
  8. Evenson, D., Jost, L. Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment. Meth Cell Sci. 22 (2-3), 169-189 (2000).
  9. B, V. L., et al. Sperm chromatin structure assay versus sperm chromatin dispersion kits: Technical repeatability and choice of assisted reproductive technology procedure. Clin Exp Reprod Med. 47 (4), 277-283 (2020).
  10. Yang, F., et al. Establishment and evaluation of a flow cytometry technique reflecting the severity of human sperm DNA damage. Zhonghua Nan Ke Xue. 26 (11), 989-995 (2020).
  11. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 5th ed., World Health Organization. Geneva. (2010).
  12. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 6th ed., World Health Organization. Geneva. (2021).
  13. Evenson, D. P. The Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci. 169 (6), 56-75 (2016).
  14. Lin, M. H., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates. Fertil Steril. 90 (2), 352-359 (2007).
  15. Virro, M. R., Larson-Cook, K. L., Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril. 81 (5), 1289-1295 (2004).
  16. Mohammadi, Z., Tavalaee, M., Gharagozloo, P., Drevet, J. R., Nasr-Esfahani, M. H. Could high DNA stainability (HDS) be a valuable indicator of sperm nuclear integrity. Basic Clin Androl. 30, 12(2020).
  17. Shen, L., et al. High sperm DNA stainability might not be an accurate predictive indicator of male fertility and assisted reproductive technology outcomes. Front Endocrinol (Lausanne). 16, 1510114(2025).
  18. Lu, J. C. High DNA stainability (HDS) should not be recommended as a marker for the detection of sperm DNA damage. Andrologia. 54 (7), e14442(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233JoVE

Похожие статьи