Цифровая платформа микрофлюидной электропорации для редактирования генома CRISPR с низким входом и трансфекции мРНК в суспензионных Т-клетках и моделях 3D-клеток

Краткое содержание

Этот протокол описывает миниатюрное редактирование генома CRISPR–Cas9 рецептора TCRα/β в первичных Т-клетках человека с использованием «DMF-экции» — цифровой микрофлюидной (DMF) электропорирующей платформы. Метод позволяет параллельно редактировать гены с низким уровнем ввода с высокой жизнеспособностью и дополнительно адаптируется для доставки мРНК в многоклеточные 3D-сфероиды.

Аннотация

Цифровая микрофлюидная (DMF) электропорация обеспечивает точную, малообъёмную генетическую манипуляцию клетками млекопитающих, при этом минимизируя клеточный вклад до 100 раз и сохраняя жизнеспособность. В данном исследовании представлен высокопроизводительный рабочий процесс трансфекции на основе DMF для нокаутирования локуса TRAC с помощью CRISPR в первичных Т-клетках человеческой суспензии и для трансфекции мРНК трёхмерных HEK293T сфероидов. С помощью пространственно отложенных направляющих РНК CRISPR и сборки рибонуклеопротеинов (RNP) на картридже было достигнуто эффективное нарушение локуса TRAC как в популяциях CD4⁺, так и CD8⁺ с использованием всего 10 000 клеток на состояние, при этом жизнеспособность после редактирования превышает 85%. Биофизическая характеристика с использованием анализа, индуцированного потоком и дисперсии Тейлора, показала, что полимерные добавки стабилизируют комплексы Cas9–sgRNA в условиях электропорационного буфера, что способствует воспроизводимому редактированию при объёмах меньше микролитров. Рабочий процесс был дополнительно адаптирован для 3D-приложений путём доставки мРНК EGFP в целостные HEK293T сфероиды, что привело к устойчивой и пространственно равномерной флуоресценции без нарушения роста сфероидов или морфологии. В совокупности эти результаты показывают, что электропорация ДМФ обеспечивает эффективное редактирование генома и доставку мРНК как между суспензионными иммунными клетками, так и многоклеточными сфероидами. Эта платформа предоставляет масштабируемое и малозатратное решение для приложений в терапии CAR-T, функциональной геномике и передовых 3D-клеточных моделях.

Введение

Редактирование генов в первичных человеческих клетках становится всё более центральным как в терапевтической разработке, так и в фундаментальных исследованиях, включая применения в иммуноинженерии, моделировании редких заболеваний и функциональной^{геномике 1}. Хотя электропорация обеспечивает высокоэффективное редактирование генома, традиционные системы на основе кувет обычно требуют до миллионов клеток на каждое состояние, что ограничивает их использование для образцов, полученных пациентами, и редких иммунных^{популяций 2}. Кроме того, эти системы плохо подходят для крупномасштабного рассеивания из-за ограничений по пропускной способности, автоматизации и потреблению^{реагентов 3}.

Микрофлюидная электропорация стала перспективным подходом для редактирования генома с низким^{входом 4}. Однако большинство существующих платформ опираются на архитектуры непрерывного потока, которые включают сложное обращение с жидкостями, ограниченную гибкость в смешивании реагентов и относительно высокие требования к ячейкам по состоянию. В отличие от этого, цифровая микрофлюидика (DMF) позволяет активно управлять дискретными нанолитровыми каплями на планарной электродной решетке, обеспечивая точное управление составом реакции, временем и пространственной локализацией. Этот формат на основе капель типа plug-and-play хорошо подходит для рабочих процессов с низким объёмом и высокой пропускной способностью, где сохранение первичных ячеек и реагентов крайне^{важно 5}.

Недавние исследования продемонстрировали возможность внутриклеточной подачи на основе ДМФ с использованием архитектур электропорации с трёхкапельными элементами, которые генерируют локализованные электрические поля с низким током для эффективной доставки RNP и мРНК при минимизации теплового и электрохимического^{напряжения 6,7,8}. Опираясь на эту основу, была разработана платформа следующего поколения DMF-электропорации под названием «DMF-ection», включающая 48 независимо адресируемых реактивных участков, полную совместимость с автоматизацией и масштабируемое производство^{картриджей 9} (рисунок 1). Картридж DMF состоит из нижней пластины печатной платы и пластиковой верхней пластины, разделённой прокладкой, собранных с помощью защитных защитков в одной правильной ориентации (рисунок 1A). Компоновка 48-плекса организована в восемь идентичных семейств (рисунок 1A–H), каждое из которых содержит шесть независимо адресуемых электропорационных сайтов, поддерживающих до 48 параллельных условий редактирования на картридж (рисунок 1B). Библиотеки направляющих РНК наносятся на поверхность подложки с помощью акустического диспенсера перед сборкой картриджа. Точность позиционирования осадки была подтверждена на всех 48 точках, при этом позиции сброса кластеризовались в пределах субмиллиметрового отклонения от середины электрода (рисунок 1C), что обеспечивает надёжную сборку RNP на картридже. После загрузки элементы и капли жидкого электрода приводятся в действие на картридже, формируя геометрию электропорации трёхкапель (рисунок 1D). После электропорации клетки перегружаются в культивированные пластины для извлечения и дальнейшего анализа, включая проточную цитометрию, секвенирование и микроскопию (рисунок 1E). Эта система обеспечивает высокоэффективное редактирование генома, используя до 100 раз меньше клеток по сравнению со стандартными методами на основе кювета, значительно расширяя доступ к геномной инженерии в приложениях с низким входом и высокой производительностью.

В данном исследовании оценивается эффективность платформы путём доставки нескольких биомолекулярных грузов, включая мРНК и комплексы рибонуклеопротеинов CRISPR–Cas9 (RNP), обеспечивая эффективную трансфекцию и нарушение генов. Помимо первичных Т-клеток, DMF-экция предоставляет обобщённую основу для доставки нуклеиновых кислот в сложные многоклеточные структуры. Трёхмерные (3D) сфероиды и органоидные модели создают значительные барьеры для проникновения реагентов из-за своей архитектуры и хрупкости, а традиционные методы электропорации часто нарушают морфологию или создают гетерогенную доставку. Чтобы оценить, распространяются ли те же миниатюрные принципы электропорации, используемые для редактирования Т-клеток, и на структурированные ткани, рабочий процесс DMF был применён к 3D HEK293T сфероидам. Эти эксперименты показали, что электроувлажнение на основе DMF может мягко позиционировать целые сфероиды внутри трикапельных геометрий и поддерживать равномерную доставку мРНК, сохраняя при этом структуру и рост. Хотя эти результаты выходят за рамки описанного здесь основного протокола Т-клеток, они иллюстрируют более широкое применение программируемой электропорации DMF для новых 3D-клеточных систем, важных для открытия лекарств и моделирования заболеваний.

Протокол

Первичные человеческие Т-клетки, используемые в этом протоколе, были получены у коммерческих поставщиков по информированному согласию донора и в соответствии с применимыми институциональными, этическими и нормативными нормами. Вся обработка биологических материалов, полученных человеком, проводилась в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности. Исследователи, внедряющие этот протокол, несут ответственность за то, чтобы их использование первичных человеческих клеток соответствовало требованиям местного институционального контроля (IRB) или этического комитета, применимым нормативам по биобезопасности и соответствующим национальным или региональным законодательным актам, регулирующим использование человеческого биологического материала. В этом исследовании не было связано с использованием клеточного материала, идентифицируемого пациентом.

1. Подготовка и активация первичных человеческих Т-клеток

1. Быстро оттаять первичные человеческие CD3⁺ Т-клетки криоконсервировать в водяной бане при температуре 37 °C. Перенесите клетки в предварительно нагретую базальную Т-клеточную среду и центрифугуйте при 180 × г в течение 10 минут. Сбросьте супернатант и снова взвешайте гранулу в свежем среде.
2. Определите концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматического счётчика ячеек.
3. Ресуспензировать клетки при 1 × 10⁶ клеток/мл в среде культуры Т-клеток с дополнением растворимого тетрамерного антитела CD3/CD28 Т-клеточного активатора (согласно инструкции производителя) и 200 МЕ/мл IL-2. Инкубировать клетки в течение 72 часов при 37 °C, 5% CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте плотность клеток в диапазоне 0,5–2 × 10⁶ клеток/мл во время активации. Выполнять активацию в пластинах с 96 лунками U-дно для оптимизации контакта и эффективности активации между элементами и активатором.

2. Подготовка направляющих РНК-пятен на субстрате DMF (акустическое обнаружение диспенсера)

1. Восстановить лиофилизированную РНК в воде без нуклеазы до запасной концентрации 100 мкм. В отдельной трубке приготовьте запас поли-L-глутаминовой кислоты (PGA, соль натрия, МВт 15 000–50 000 Да) в воде без нуклеазы. Объедините sgRNA и PGA stock в объёмном соотношении 5:4 (sgRNA: PGA), что даёт итоговую концентрацию sgRNA 55,6 pmol/μL и конечную концентрацию PGA 44,4 мг/мл в воде без нуклеазы. Кратковременно вихрь и центрифуга при 1 000 × г в течение 30 секунд и аликвоты в одноразовых объёмах, а неиспользованные аликвоты хранят при −80 °C до 6 месяцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания.
2. Добавьте смесь направляющего и PGA на акустическую исходную пластину с низким мертвым объёмом в колодцах, соответствующих желаемой схеме реагирующей площадки.
3. Передайте 40 нл (эквивалентно 2,2 пмоль sgRNA) смеси направляющей-PGA в каждую область обнаружения целей субстрата DMF с помощью калиброванного акустического дозера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: при 55,6 пмоль/мкл 40 нл обеспечивает 2,2 пмоль sgRNA на участок (55,6 × 0,040 = 2,22 пмоль). Высушенные направляющие восстанавливаются при слиянии капель на картридже; Полная подвеска подтверждается стабильной эффективностью редактирования на разных площадках.
4. В биологическом защитном шкафу дайте пятнистым каплям полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре, пока видимая жидкость не останется (примерно 5 минут).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте принудительный поток воздуха или нагрев, так как это может вытеснить или ухудшить направляющую РНК.
5. Соберите патрон DMF.
   1. В биологическом шкафу безопасности выровняйте верхнюю пластину поверх пятнистого подложки, сопоставив асимметричные пластиковые элементы защелкивания верхней пластины с выемками на нижней. Равномерное, одновременное давление вдоль коротких краёв до тех пор, пока не почувствуется явный механический щелчок, подтверждающий полное восприятие фиксирующих элементов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Картридж разработан с одной правильной ориентацией; неправильная сборка не приведёт к защелканию. Держите подложки за края постоянно, чтобы избежать загрязнения или повреждения функциональных поверхностей, а также не скользите подложки друг о друга, так как это может поцарапать поверхностные покрытия.
   2. Контрольная точка: Подтвердите правильную сборку механическим кнопкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет предварительного электрического индикатора целостности покрытия; любые функциональные сбои, вызванные неправильной сборкой, автоматически обнаруживаются и сообщаются в отчете по контролю качества после запуска.
      Точка паузы: храните неиспользованные собранные картриджи в герметичной упаковке с осушителем (пакетами силикагеля) при комнатной температуре до 48 часов.

3. Подготовка клеток

1. Перед каждым применением подготовьте 1 мл полного буфера трансфекции свеже, комбинируя термопорационный буфер, совместимый с DMF, с предоставленным биосовместимым неионным поверхностно-активным веществом в соотношении 20:1 (буфер электропорации: поверхностно-активное вещество), обеспечивая итоговую концентрацию ПАВ 0,05% (v/v). Аккуратно перемешайте и держите на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DMF-совместимый трансфекционный буфер, используемый здесь, представляет собой низкопроводный, изотонический буфер (проводимость: 3,5 мС/см, осмолальность: 305 мОсм/л). Исследователи, использующие альтернативные буферы, должны проверить совместимость с DMF-приводом и жизнеспособность клеток. Биосовместимый неионный поверхностно-активный материал служит для уменьшения фиксации капель; если предоставленное поверхностно-активное вещество не используется, то подходящая замена.
2. Один раз промывайте активированные Т-клетки с помощью Transfection Buffer (не содержащего ПАВ). Центрифугировать при 180 × г в течение 5 минут, аспирировать супернатант и повторно суспензировать клеточную гранулу в полном трансфексионном буфере (содержащем поверхностно-активное вещество) при 1,0 × 10⁷ клеток/мл при общим объёме 100 мкл на картридж. Держи на льду.
3. Непосредственно перед загрузкой на картридж добавьте нуклеазу Cas9 непосредственно к 100 мкл T-элементной суспензии и смешайте с помощью аккуратного пипетирования; Держи на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичных Т-элементов Cas9 заряжается при 42 пмоль на 100 мкл объёма картриджа (0,42 пмоль/мкл). Каждый участок электропорации обрабатывает примерно 1 мкл суспензии ячейки, обеспечивая 0,42 пмоль Cas9 за одну редакцию. Оптимизируйте эту дозировку при адаптации к другим типам иммунных клеток (см. таблицу 1).

Компонент	Итоговая концентрация на редактирование
Cas9	0,42 пмоль в ~1 мкл капли
sgRNA	2,1 пмоль (от точки 40 нл)
PGA	44,4 мг/мл в смеси для спотирования
Поверхностно-активное вещество	0,05% (v/v)
Вход ячейки	~10 000 ячеек

Таблица 1: Сводная таблица конечных концентраций в каждой капле трансфекции.

4. Трансфекция на платформе DMF-ection

1. Используя многоканальную пипетку, впустите 10 мкл смеси T-элемента/Cas9 в каждый из 8 портов загрузки ячеек и 10 мкл полного буфера трансфекции в 16 портов загрузки жидких электродов (как показано на рисунке 1).
2. Установите напряжение на 500 В, длительность импульса на 3 мс и количество импульсов на 2. Инициируйте последовательность электропорации согласно инструкциям платформы.
   1. Контрольная точка: Просмотрите отчёт по QC после пробега сразу после забега. Спорадические отказы (<10% участков) не требуют вмешательства. Если сбои систематические, замените картридж на предоставленную плату контроля качества, проведите проверку состояния системы (~2 минуты) и обратитесь в техническую поддержку, если проблемы сохраняются.

5. Разгрузка и восстановление отредактированных Т-клеток

1. С помощью жидкостного обработчика перенесите электропорированные ячейки из каждого места реакции в 96-колодную U-дно пластину, содержащую 150 мкл предварительно нагретой базальной Т-клеточной среды с добавлением 200 МЕ/мл IL-2.
2. Инкубировать клетки в течение 72 часов при 37 °C, 5% CO₂, чтобы обеспечить смену белков и изменения экспрессии поверхностных рецепторов.

6. Анализ проточной цитометрии нокаутирования TRAC

1. Перенесите клетки на стерильную коническую нижню пластину с 96 лунками, чтобы уменьшить потерю между промывками. Промыйте клетки дважды буфером проточной цитометрии (1× PBS, 2% FBS, 2 мМ EDTA), центрифугировав при 400 × г в течение 5 минут и удаляя супернатант, аккуратно переворачивая коническую нижнюю пластину. Клетки останутся гранулированными в пластине.
2. Приготовьте мастер-микс для поверхностного окрашивания, содержащий антитела анти-CD4, анти-CD8 и анти-TCRα/β в буфере Flow Cytometry в рекомендованных производителя концентрациях. Добавьте 25 мкл главной смеси в каждую скважину и инкубуйте 20 минут при 4 °C, защищённые от света. Постирайте дважды с 1× PBS (без FBS), центрифугируя при 400 × г в течение 5 минут. Суспензировать клетки в 100 мкл по 1× PBS с жизнеспособным красителем при 1:1 000 (v/v) и инкубировать 10 минут при комнатной температуре, защищённой от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конические нижние пластины эффективны для гранулирования клеток; Проверьте, что клетки хорошо подвешены на всех этапах.
3. Промывайте клетки дважды буфером проточной цитометрии и повторно суспензируйте в 150–200 мкл на образец для сбора.
4. Настройте цитометр с соответствующими лазерными линиями и наборами фильтров для используемых флуорохромов (например, возбуждение 488 нм для красителя жизнеспособности; 405 нм или 488 нм для поверхностных маркеров по мере необходимости). Устанавливайте напряжения с помощью однократных регуляторов компенсации и неокрашенного образца. Соберите минимум 5 000 живых синглет-мероприятий на каждый образец. Гейт последовательно на: рассеивающие синглеты → живые клетки (отрицательный краситель жизнеспособности) → CD4⁺ или CD8⁺ → экспрессии TCRα/β.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При стандартных условиях общее количество живых событий может варьироваться от 5 000 до более чем 10 000 на образец после потерь при промывке и окрашивании, при условии, что клетки успели размножиться.
5. Определите нарушение гена TRAC , измеряя частоту TCRα/β-отрицательных клеток в популяциях CD4⁺ и CD8⁺. Отчёт эффективности knockout как процент TCRα/β-отрицательных ячеек относительно живого синглетного элемента для каждого подмножества.

Результаты

Ожидаемые результаты
Электропорация 10 000 активированных Т-клеток за каждое состояние обычно приводит к >85% эффективности нокаутирования TRAC с >95% жизнеспособностью через 72 часа после трансфекции. Проточная цитометрия показывает явную потерю окрашивания TCRα/β в условиях TRAC-таргетирования по сравнению с нетаргетируемыми sgRNA контролями (NTC) и контролями, не подвергающимися электрическим полям. Если не указано иное, n обозначает независимые DMF-экцион...

Обсуждение

Этот протокол описывает миниатюризированный цифровой микрофлюидный электропорация, который обеспечивает эффективную внутриклеточную доставку в первичные Т-клетки человека с помощью каплей масштаба нанолитра. Основным преимуществом этого метода является возможность редактирования генома CRISPR–Cas9 с использованием всего 10 000 клеток за реакцию, что значительно снижает требования к материалам по сравнению с традиционной электропорацией. Архитектура на основе капель поддерживает автоматиз...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Инструменты
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Протокол сфероидов
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Протокол сфероидов
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 в 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Инструменты
DMEM Media	Gibco	10564011	Добавка к среде - Культура сфероидов
DMF compatible buffer	DropGenie		Трансфекция
DropGenie Transfection System	DropGenie		Инструменты
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Инструменты
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Добавка к среде - Культура сфероидов
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Инструменты
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Протокол сфероидов
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Добавка к среде Т-клеток
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Периферическая кровь, криоконсервированная, пан-CD3+ Т-хелперы, отрицательно отобранные
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Среда для активации Т-клеток
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Среда для активации Т-клеток
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Инструменты
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Инструменты
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 в 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 в 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Добавка к среде - Культура сфероидов
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Использовать на концентрации 100мг/мл
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Программное обеспечение
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Протокол сфероидов
Surfactant F	DropGenie		Трансфекция- использовать в соотношении 1:20 в DMF совместимом буфере для получения полного трансфекционного буфера
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Протокол сфероидов