Алгоритм анализа формы количественно определяет пространственную морфологию и контекст культуры клеток от 2D до 3D для новых количественных фенотипов

Краткое содержание

В этой статье объясняется, как новые морфологические признаки в клетках и органоидах можно количественно оценить с помощью линейного преобразования сжатых полярных координат (LCPC) — пространственного алгоритма, который фиксирует свойства, которые традиционные метрики, такие как площадь, объём и площадь поверхности, не могут зафиксировать. Обсуждаются лучшие практики по ориентации и выравниванию формы.

Аннотация

Многочисленные исследования показали, что морфологический фенотип клетки или органоида коррелирует с её восприимчивостью к противораковым препаратам. Однако традиционные методы измерения фенотипа опираются на пространственные метрики, такие как площадь, объём, периметр и интенсивность сигнала, которые работают, но ограничены. Эти подходы не могут измерять многие ключевые признаки пространственного контекста, такие как хиральность — свойство леворукости и правшей. Громкость не может быть использована для регистрации хиральности, потому что левая и правая обувь имеют одинаковую громкость. Хотя пространственный контекст в виде хиральности, направления гравитации и оси полярности интуитивно понятен человеку, традиционные метрики, используемые клеточными биологами, патологами, радиологами и практиками машинного обучения до сих пор не могут отразить эти фундаментальные понятия. Преобразование линейных сжатых полярных координат (LCPC) — это новый алгоритм, способный захватывать пространственный контекст, не похожий ни на одну другую метрику. Преобразование LCPC преобразует двумерный (двумерный) контур в дискретную синусоидальную волну, накладая сетку, которая отслеживает точки пересечения между контуром и линиями сетки. Он превращает контур в последовательность пар дискретных координат, при этом независимая координата (x-координата) соответствует последовательным позициям в двумерном пространстве. Каждая зависимая координата (y-координата) состоит из расстояния между пересечением контура и линии сетки с началом или базовой линией сетки. В виде дискретной синусоидной волны к данным применяется быстрое преобразование Фурье. Таким образом, формы клеток в 2D и 3D-культуре систематически и многомерно представлены, что позволяет проводить надёжную количественную стратификацию и открывать представления о устойчивости к лечению.

Введение

Трёхмерная (3D) органоидная культура доказала превосходство двумерной (2D) клеточной культуры в имитации биологии in ^{vivo 1,2}. Органоиды стали незаменимыми в исследованиях рака для скрининга эффективного лечения и получения информации о прогрессировании^{болезни} 3,4,5,6. Хотя в биологии рака хорошо известно, что различия в морфологии коррелируют с особым биологическим поведением клеток и тканей, область опирается на традиционные метрики формы, которые ограничены по охватам. В данном исследовании описывается новый пространственный алгоритм, который объективно количественно оценивает тонкие морфологические особенности с беспрецедентной точностью, превосходя традиционные подходы, такие как площадь, объём и площадь поверхности.

Преобразование линеаризованных сжатых полярных координат (LCPC) было изобретено для объективного и количественного описания сложных морфологий, наблюдаемых в гистопатологии тканей, с целью улучшения градации полий толстой^{кишки 7}. Желание затем расширить этот подход для отображения макроскопических пространственных особенностей на основе МРТ в патологиях мозга, таких как биполярное расстройство и болезнь Альцгеймера, привело к дополнениям, которые ещё больше его усилили. В этом исследовании описывается пошаговый протокол и лучшие практики применения двух версий преобразования LCPC: системы параллельной сетки и системы радиальной сетки, обе из которых имеют открытые скрипты и обучающие видео.

Помимо традиционных геометрических методов, существует множество абстракций, которые оказались эффективными для измерения сложных форм клеток и органов. К ним относятся измерения эксцентриситета, наклонности, контраста и куртоза, а также моменты Цернике для фиксации круговости, асимметрии, неровности рёбер и глобальной структуры^{контуров 8,9,10}. Фрактальный анализ также полезен для сведения сложных контуров до скалярных значений, например, Фрактальное измерение, измеряющее неправильность контура, и лакунарность, измеряющее, как гетерогенно нерегулярные промежутки появляются в^{контуре 11,12}. Для измерения текстуры популярен метод матрицы совместимости серого уровня (GLCM) для измерения контраста, энергии, однородности, корреляции и энтропии^13,14. Хотя все эти методы полезны, ни один из них не был разработан для отражания пространственного контекста, такого как направление гравитации, леворукость или праворукость, или расположение центральной опоры, влияющей на направление изменения формы. Кроме того, многие из них дают одно скалярное значение или лишь несколько скалярных значений для представления пространственной информации, поэтому в приведённых исследованиях часто используются их в комбинации для оценки сложных форм.

Преобразование LCPC было разработано для получения множества признаков из одного измерения и для добавления пространственных маркеров, кодирующих пространственный контекст в форму, например, направление гравитации. Ближайший метод к преобразованию^{LCPC 7} был опубликован год^{спустя 15}, разделяя основную идею в качестве отправной точки: применить преобразование Фурье к контурам ячеек для измерения формы в виде частотного спектра. Однако преобразование LCPC было независимо разработано для применения через отдельные сеточные системы, предназначенные для использования в сочетании с знанием пространственного контекста вне измеряемой формы. Кроме того, изобретатель преобразования LCPC объясняет в этой рукописи, что полученный частотный спектр содержит огромные объёмы скрытой пространственной информации. Дополнительный файл 1 содержит подробное обсуждение пространственных контекстов в биологии, которые часто упускаются из виду при использовании упомянутых методов, и того, как преобразование LCPC может быть применено для отражения этого контекста. Для читателей, чьи данные по форме не показывают различий между контрольными и экспериментальными группами, независимо от того, видят ли их глаза разницу в формах, или чьи данные о форме почти не показывают различий, хотя они подозревают, что разница должна быть большей, стоит попробовать преобразование LCPC.

Преобразование LCPC обеспечивает беспрецедентную точность измерения пространственной информации, поскольку представляет формы в нескольких измерениях. В отличие от традиционных методов, таких как площадь и объём, которые дают только одно скалярное значение на фигуру (то есть 25^{см 2}), результаты преобразования LCPC могут давать несколько индексов, каждый из которых коррелирует с разным морфологическим аспектом формы (то есть округлость против резкости углов, гладкость против зубчатости рёбер). Преобразование LCPC описывает двумерную форму путём наложения сетки прямых линий, пересекающих её контур. Каждая система сетки имеет начало координат (рисунок 1) или базовую линию (рисунок 2), по которой измеряется линейное расстояние. См. рисунки 1B и 2B для упрощённых блок-схем, описывающих алгоритм. Обнаруживается каждая точка пересечения между линиями сетки и контуром формы. Расстояние каждого пересечения затем рассчитывается относительно базовой линии или начала координат. Таким образом, преобразование LCPC преобразует двумерные фигуры в последовательность последовательных пар координат x-y. x-координата обозначает положение линии сетки от нуля до бесконечности, а y-координата — расстояние от пересечения до базовой линии или начала координат. В этой форме, которая является дискретной синусоидной волной, затем применяется быстрое преобразование Фурье (FFT) для преобразования данных из «позиционной области» в частотную область. Если x-координата обозначает время, то «область положения» будет эквивалентна «временной области» в стандартных приложениях FFT.

В то время как радиальная сетка измеряет расстояние каждого пересечения от начала радиальной сетки (рисунок 1A), параллельная система всегда измеряет расстояние пересечений относительно воображаемой линии слева от фигуры (рисунок 2A). Открытый скрипт определяет положение этой воображаемой линии, находя самый левый пиксель контура и затем сдвинув 10 пикселей влево от этой позиции. Здесь x-координата этой позиции становится опорной линией, с которой вычисляются все пересечения. Это правило 10 пикселей произвольно, но именно поэтому все контуры, анализируемые открытым скриптом для системы параллельной сетки, должны иметь не менее 15 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон.

Для двумерных фигур с складками или несколькими слоями линии сетки могут пересекать контур более одного раза. В этом случае расстояния всех пересечений вдоль линии сетки суммируются в одно значение. Таким образом, каждая линия сетки имеет только одну x-координату и одну y-координату. Это суммирование представлено термином «сжатый» в названии преобразования LCPC. Отображение нелинейной двумерной фигуры в дискретную синусоидную волну обозначается термином «линеаризованный» в названии алгоритма. Наконец, термин «полярные координаты» в названии алгоритма, потому что первой концепцией была радиальная сетка с полярными^{координатами} 7 с углом 180 градусов. Даже после осознания взаимозаменяемости полярных и декартовых координат название алгоритма осталось без изменений. Раздел благодарностей описывает личные причины, которые побудили изобретение и усовершенствование преобразования LCPC.

Протокол 1 был последовательностью получения данных, показанных на рисунке 3B, а протокол 2 — последовательностью получения данных, показанных на рисунке 3C–D. Шаги в этих протоколах реализованы в отдельных скриптах на Python, доступных в репозитории GitHub «Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform^»16. Протокол 1 является примером этапов предварительной обработки для получения «чистой формы» в подготовке к преобразованию LCPC. Протокол 2 — пример этапов предварительной обработки для измерения форм «в масштабе», то есть на их исходных масштабах относительно друг друга.

Сегментацию можно выполнять вручную в программном обеспечении для обработки изображений, таких как Mac Preview или Microsoft Paint, либо с помощью пороговых методов. Если делать это вручную, следует выбрать один из следующих четырёх цветов: синий, зелёный, розовый/пурпурный или красный. Репозиторий GitHub под названием «Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform^»16 содержит папку под названием «color extraction scripts». Эта папка содержит четыре файла Jupyter Notebook с кодом на Python, которые извлекают эти четыре цвета и преобразуют их в синие маски на белом фоне. Этот процесс также можно выполнить, ограничивая пороговый цвет контура в программном обеспечении для обработки изображений, таком как Fiji/ImageJ. Для изображений, содержащих контуры с касающимися границами или перекрывающимися краями (например, диаграмма Венна), их необходимо разделить с помощью программного обеспечения для обработки изображений, чтобы они стали независимыми объектами в составном масковом изображении с несколькими органоидными контурами. Это не относится к изображениям, содержащим только один органоид, или к нескольким органоидам, не соприкасающимся друг с другом.

Протокол

Первичные человеческие клетки, использованные в этом исследовании, были получены и культивированы в соответствии с этическими одобрениями и процедурами информированного согласия, ранее^{сообщавшихся 17}. Представленные здесь изображения были получены из этих одобренных клеточных культур и опубликованы впервые. Образцы тканей были собраны в больнице Brigham and Women's и Калифорнийском университете в Сан-Франциско по протоколам, утверждённым Institutional Review Board (IRB), у пациентов, предоставивших информированное согласие на использование своих тканей в исследованиях, как было описано^{ранее 17}. Для этого исследования не проводилось дополнительного сбора образцов на людях.

1. Извлечение чистой формы двумерных органоидных контуров для преобразования LCPC

1. Сегментируйте внешний край каждого органоида с помощью любого программного обеспечения для обработки изображений, таких как Microsoft Paint, MacOS Preview или Fiji/ImageJ.
2. Выделите контуры органоидов в виде открытых масок в виде синих линий на белом фоне.
3. Изолируйте каждый синий контур на отдельном белом холсте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только если изображение содержит более одного контура.
4. Обрежьте каждый контур так, чтобы с четырёх сторон синего объекта было по одному пикселю.
5. Добавьте 100 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон, чтобы создать новые поля.
6. Вращайте объекты так, чтобы максимальная внутренняя длина была горизонтальной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг превращает самую длинную внутреннюю линию внутри каждого объекта в ширину объекта. Для этой цели доступны два сценария. Для замкнутых фигур используйте Jupyter Notebook под названием «Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb». Для открытых форм или форм с несколькими компонентами используйте Jupyter Notebook под названием «Rotate Green Line_v3.ipynb». Инструмент Rotate Green Line содержит видеоурок, который связан в файле ReadMe, находящейся в той же папке, что и файл .ipynb.
7. Обрезайте каждое изображение так, чтобы поля была по одному пикселю со всех четырёх сторон синего объекта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это то же самое, что и шаг 1.4. Однако цель обрезания в этот раз в том, что следующий этап изменения размера меняет размер всего холста, а не только синего объекта на нём. Таким образом, делая синий объект почти такой же ширины и высоты, как сам холст, изменение размера холста до 400 пикселей также увеличивает размер объекта почти до 400 пикселей. Существует Jupyter Notebook под названием «Trim margin to 1-pixel border.ipynb».
8. Измените ширину холста каждого изображения до 400 пикселей, одновременно ограничивая соотношение сторон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе каждый объект имеет одинаковую ширину. Ограничение соотношения сторон предотвращает смещение объекта при изменении размера. Существует Jupyter Notebook под названием «Resize width to 400 pixel, но consate aspect ratio.ipynb».
9. Добавьте 100 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон, чтобы создать новые поля.
10. Поворачите каждое изображение на 90 градусов по часовой стрелке или против часовой, чтобы получить максимальную внутреннюю вертикальную длину, что соответствует выбору для всех изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведённой выше последовательности чистая форма получается последовательной реализацией шагов 1.6, 1.7, 1.8 и 1.9. Добавление поля в шаге 1.9 необходимо для предотвращения ошибок в скриптах преобразования LCPC, которые будут выполнены дальше, но не участвуют в извлечении чистой формы. Пользователям, желающим измерять фигуры «в масштабе», не обязательно выполнять шаги 1.6, 1.7 и 1.8 в приведённой выше последовательности, хотя им всё равно следует предварительно обработать изображения масок, чтобы достичь оптимальной ориентации перед применением преобразования LCPC.
11. Выполните преобразование LCPC на каждом контуре. Используйте скрипты Python, предусмотренные для метода радиальной^{сетки 18} или метода параллельной^{сетки 19}.

2. Извлечение масштабной формы двумерных органоидных контуров для преобразования LCPC

ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговый метод извлечения масштабной формы объектов схож с тем, что используется в Протоколе 1 выше. Шаги имеют идентичные названия в обоих протоколах для удобства сопоставления. Пожалуйста, ознакомьтесь с заметками в Протоколе 1 для каждого шага. Главное отличие между чистой формой и формой в масштабе в том, что для правильной формы не требуется шаги 1.6, 1.7 и 1.8, которые являются шагами изменения размера.

1. Сегментируйте внешний край каждого органоида. Используйте вычислительный подход или делайте это вручную с помощью базового программного обеспечения для редактирования изображений, таких как Microsoft Paint, MacOS Preview или Fiji/ImageJ.
2. Извлеките контуры органоидов в виде открытых масок — синих линий на белом холсте. Используйте Fiji/ImageJ для извлечения масок или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
3. Изолируйте каждый синий контур на отдельном белом холсте. Используйте Fiji/ImageJ для извлечения масок или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
4. Обрежьте каждый контур так, чтобы с четырёх сторон синего объекта было по одному пикселю. Используйте Fiji/ImageJ или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
5. Добавьте 100 пикселей белого пространства со всех четырёх сторон, чтобы создать новые поля. Используйте Fiji/ImageJ или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
6. Вращайте каждый контур так, чтобы его самая длинная внутренняя линия была вертикальной. Используйте Fiji/ImageJ или предоставленный скрипт на^{Python 16}.
7. Выполните преобразование LCPC на каждом контуре. Используйте скрипты Python, предусмотренные для метода радиальной^{сетки 18} или метода параллельной^{сетки 19}.

Результаты

Радиальная сетчатая преобразование LCPC, применяемое к органоидам рака молочной железы

3D-органоиды и опухоли могут принимать различные формы, некоторые из которых явно отличаются от человеческого глаза, хотя традиционные метрики дают статистически незначительные различия. С другой стороны, органоиды также могут демонстрировать формы, которые кажутся гетерогенными и, следовательно, незначительными для человеческого глаза, скрывая повторяющиеся...

Обсуждение

Как и в любом вычислительном инструменте, качество вывода зависит от того, соответствуют ли входные данные ожидаемым правилам, вокруг которых был спроектирован инструмент. Следующие правила следует соблюдать и использовать в качестве проверки качества при использовании предоставленных скриптов на Python. Во-первых, убедитесь, что открытые маски имеют синие линии на белом фоне. Синий был произвольным решением и не имеет значения, но скрипты, выполняющие преобразование LCPC, были написаны ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook