Обзорная статья

Стандартизация в аналитической характеристике адено-ассоциированных вирусных векторов (AAV)

DOI:

10.3791/71152

⸱

10 июля 2026 г.

 ,  , 
1Trellis Research Group, Department of Cellular and Molecular Medicine, Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KU Leuven, 2Virus-Host Interactions & Therapeutic Approaches Research Group, Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KU Leuven

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генная терапия с аденоассоциированными вирусами (AAV) требует хорошо охарактеризованных стандартных эталонных материалов (RSM) для обеспечения точных и воспроизводимых аналитических измерений внутри и между лабораториями. Этот обзор рассматривает критическую потребность в RSM, оценивает доступные коммерческие и фармакопейные стандарты и предлагает практические стратегии для внутренней разработки RSM с целью продвижения безопасных и эффективных терапевтических средств AAV.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Адено-ассоциированный вирус (AAV) стал ведущим вектором генной терапии in vivo, в настоящее время восемь продуктов имеют разрешение на маркетинг. По мере быстрого развития отрасли потребность в надёжных аналитических методах для характеристики критических атрибутов качества (CQA) — включая титр капсида, титр генома, содержание капсида (соотношение пустот/полный), идентичность и чистоту — продолжает расти. Эталонные стандартные материалы (RSM) играют ключевую роль, предоставляя хорошо охарактеризованные, стандартизированные партии AAV, которые служат универсальными ориентирами. RSM способствуют валидации новых аналитических технологий, обеспечивают точность и воспроизводимость рутинных анализов, а также обеспечивают межлабораторную сопоставимость. Однако разработка универсальных AAV RSM фундаментально ограничена сложной биологией, разнообразием серотипов, векторных геномов и инженерных вариантов капсидов, что требует стандартов, специфичных для серотипов и применения. Недавние достижения, включая выпуск фармакопеальных эталонных стандартов AAV8, характеризующихся множеством ортогональных методов, представляют собой значимый прогресс в гармонизации измерений. Этот обзор рассматривает критическую потребность в РСМ в генной терапии AAV, оценивает существующие фармакопейные и коммерческие стандарты и определяет практические стратегии внутренней разработки РСМ. Создание надёжных, серотип-специфичных ААВ-РСМ и гармонизированных стандартных операционных протоколов (СОП) необходимо для продвижения генной терапии AAV и обеспечения точности, воспроизводимости и безопасности в исследованиях, разработках и клиническом производстве.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генная терапия предлагает трансформационную стратегию лечения генетических и приобретённых заболеваний, доставляя функциональный генетический материал в клетки пациента для коррекции или регулирования экспрессии генов. Среди них аденоассоциированные вирусы (AAV) выделяются применением in vivo благодаря разнообразному тропизму тканей в различных серотипах и устойчивой экспрессии эпизомальныхтрансгенов 1.

AAV — это компактные (диаметром ~25 нм) ДНК-вирусы рода Dependoparvovirus семейства Parvoviridae . Эти вирусы не являются патогенными и имеют дефекты репликации, поэтому длярепликации 2 требуются вспомогательные вирусы, такие как аденовирус или вирус простого герпеса. Геном AAV состоит из двух генов — rep и cap, окружённых двумя палиндромными повторами с 145 парами оснований, известных как инвертированные терминальные повторы (ITRs)3. Рекомбинантные векторы AAV (rAAV) создаются путём замены вирусных кодирующих последовательностей на терапевтические кассеты, содержащие промотор, трансген и регуляторные элементы, окружённые ITR. Во время производства гены rep и cap доставляются в транс, что облегчает репликацию и упаковку терапевтической кассеты в вирусные капсиды, а также образует неинтегрирующиеся частицы с дефицитом репликации, которые сохраняют устойчивую способность к трансдукции и предотвращают репликацию вирусов дикоготипа 4. Восемь генных терапий на базе rAAV получили разрешение на маркетинг либо от Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA), либо от Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), и количество клинических испытаний с AAV набирает популярность. По состоянию на январь 2025 года в мире зарегистрировано 343 клинических испытания AAV, что на 34% больше по сравнению с 255 исследованиями в середине 2022года. Это быстрое расширение клиники усиливает необходимость в строгом контроле качества для обеспечения безопасностипациентов 6.

Обеспечение безопасности и эффективности продуктов rAAV для использования человеком требует тщательной характеристики критически важных характеристик качества (CQA), включая количество, мощность, чистоту, идентичность, безопасность и стабильность. Однако характеристика AAV остаётся по своей сути сложной из-за структурных особенностей этих векторов. AAV — это икосаэдрические частицы, состоящие из трёх вирусных капсидных белков (VP1, VP2, VP3), собранных примерно в соотношении 1:1:10, и вариации в составе белка могут влиять на эффективностьтрансдукции 7. Терапевтическая ДНК-нагрузка должна быть упакована в капсид с высокой точностью; Гетерогенные популяции капсидов по своей природе формируются при производстве rAAV, состояя из капсидов с полным геномом (полные капсиды), частичным геномом (частично заполненные капсиды) или без генетического материала (пустые капсиды). Дополняет эту сложность различные серотипы AAV с отличительной эффективностью упаковки, тропизмами тканей и иммунологическими профилями, что требует разработки серотипического анализа. Помимо этих биологических проблем, существует критическая проблема в том, как проводятся измерения. Разные лаборатории используют разные анализы, протоколы и подходы к анализу данных для измерения одного и того же CQA. В результате сообщаемые значения для одинаковых образцов могут различаться на порядки междуучастками 8. Даже внутри одной лаборатории изменения со временем в реагентах, приборах, операторах или настройках анализа могут привести к изменениям результатов из той жепартии 9. Когда измерения несравнимы, установление надёжных связей между CQA и доклиническими или клиническими результатами становится сложно, что усложняет принятие регуляторныхрешений 10,11.

Стандартизация направлена на решение этой проблемы, обеспечивая сопоставимость измерений. В фармацевтической аналитике стандартизация включает два ключевых аспекта: использование общих физических эталонных стандартных материалов (RSM) и соблюдение гармонизированных подробных письменных стандартных операционных процедур (SOPs), что гарантирует, что разные лаборатории последовательно измеряют титр, идентичность, качество, эффективность ичистоту 12. RSM — это хорошо охарактеризованные образцы, которые служат эталоном. Проверяя анализы по одному и тому же RSM, лаборатории закрепляют свои измерения на общей точке отсчёта. Это снижает вариабельность между лабораториями и позволяет надёжно сравнивать результаты различных исследований, продуктов и производственныхплощадок 13. Кроме того, он служит внутренним органом контроля для мониторинга эффективности анализов и согласованности современем 14. SOPs дополнительно обеспечивают последовательное выполнение аналитических методов в лабораториях, минимизируя вариабельность, возникающую из-за различий в предварительной обработке образцов, инструментах, стратегии калибровки, обработке данных и практикеоператора 8,9,12. Вместе эти два компонента составляют основу надёжной аналитической стандартизационной системы.

Этот обзор систематически рассматривает ключевые аспекты стандартизации в аналитике AAV. Мы исследуем типы РСМ и их аналитические применения, оцениваем доступные в настоящее время специфические для AAV РСМ на их пригодность к назначению и предоставляем обобщённые практические рекомендации по внутреннему производству, очистке, характеристике и хранению РСМ. Мы дополнительно выявляем существующие производственные проблемы и аналитические ограничения. Понимая, что одних RSM недостаточно, мы также обсуждаем гармонизированные SOPs как дополняющий и не менее важный компонент стандартизации. Вместе этот обзор предназначен как практический справочник для аналитических учёных, специалистов по качеству и производителей, стремящихся продвинуть гармонизацию измерений и поддерживать научно обоснованное принятие нормативных решений в генной терапии AAV.

Обзор и перспектива

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RSM: определения и потребность

РСМ организованы иерархически, с двумя основными типами: первичными и вторичными РСМ. Согласно ISO Guide 30, первичный стандарт определяется как «стандарт, который признан или широко признан обладающим наивысшими метрологическими качествами и чья ценность принимается без ссылки на другие стандарты того же объёма в определённом контексте». Например, RSM из Фармакопеи США (USP), Европейской фармакопеи (Ph. Eur), Британской фармакопеи (BP) и др., которые были широко охарактеризованы в ходе многолабораторных исследований, считаются первичными RSM. Отдельные производители впоследствии используют эти первичные RSM для калибровки и квалификации собственных рабочих эталонных материалов, которые служат вторичными RSM для рутинного тестирования качества12,15. Таким образом, ISO определяет вторичный RSM как «стандарт, значение которого присваивается в сравнении с первичным стандартом той же величины». Такой иерархический подход обеспечивает прослеживаемость: внутренние измерения восходят к первичным стандартам, которые, в свою очередь, характеризуются с помощью современных аналитическихметодов 16. Использование RSM предоставляет общие ориентиры, позволяющие производителям калибровать и валидировать свои аналитические методы по одной и той же точке отсчёта, что приводит к более точным измерениям. Регуляторные органы, соответственно, поощряют использование первичных RSM для калибровки внутренних RSM и валидации методов тестирования, что повышает согласованность во всём производствеAAV 17,18. Это позволяет стандартизировать различные аналитические методы, что приводит к лучшему сравнению результатов характеристик rAAV между лабораториями и различнымипродуктами 17,19. Улучшенная сравнимость углубляет понимание рисков безопасности, потенциально связанных с высокими дозами или примесиями, связанными с продуктом, такими как пустые и частично заполненные капсиды. В конечном итоге эти инсайты могут повлиять на формулировку научной нормативной политики, например, минимальный порог полного количества капсидов, аналогичный критерию ≥70% жизнеспособных клеток для соматических клеточных терапий, тем самым способствуя созданию более безопасных и надёжных продуктов генной терапии 13,20,21.

Для rAAV несколько CQA ясно иллюстрируют необходимость стандартизации. Титр векторного генома напрямую определяет дозу пациента; Неточные титры рискуют недозащитной или передозировкой. Количественное ПЦР (qPCR) и цифровое ПЦР (dPCR) широко используются для измерения титра, но результаты могут отличаться для одной и той же выборки, если используются разные стандартные калибры или протоколыкривой 11. Содержание капсидов (соотношение полных, частично заполненных и пустых капсидов) — ещё один критический CQA, так как пустые и частично заполненные капсиды могут способствовать иммуногенности или снижатьэффективность 6. Для измерения содержания капсидов используется более десяти различных методов, включая аналитическую ультрацентрифугировку (AUC), хроматографию с исключением размеров в сочетании с многоугольным световым рассеянием (SEC-MALS), масс-фотометрию (MP), масс-спектрометрию обнаружения заряда (CDMS), электронную микроскопию (EM), анионообменную (AEX) хроматографию, капиллярную изоэлектрическую фокусировку (cIEF), ультрафиолетово-видимую спектроскопию (UV/Vis) и др. Кроме того, содержание капсидов часто оценивается косвенно с помощью соотношения титра векторного генома к вирусному титру частиц, определяемого с помощью qPCR или dPCR и ELISA соответственно (PCR/ELISA)22. Каждая техника измеряет разные физические свойства и может сообщать разные значения содержания капсидов для одних и тех же образцов. Недавнее межлабораторное исследование NIST, сравнивающее UV/VIS, AUC, SEC-MALS и PCR/ELISA, показало значительную изменчивость между методами и между лабораториями, при этом PCR/ELISA показали особенно низкую воспроизводимость, а AUC — значительную дивергенцию между лабораториями, несмотря на широкое признание эталонногометода 8. Эти результаты показывают, что для снижения вариабельности аналитики AAV требуется как общие RSM, так и гармонизированные аналитические рабочие процессы, как обсуждается в разделе 5.

2. Ландшафт rAAV RSM

Попытки создать RSM для AAV привели к появлению двух источников, предоставляющих первичные AAV RSM. Среди фармакопейных источников USP в настоящее время является единственным поставщиком первичного AAV RSM. Помимо USP, основные AAV RSM также доступны из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Также доступен растущий ассортимент коммерческих вторичных RSM для нескольких серотипов, что отражает продолжающиеся усилия сообщества по устранению проблемы отсутствия стандартизации, присущей характеристике AAV. Таблица 1 обобщает доступные в настоящее время материалы AAV RSM и их ключевые характеристики.

  1. Стандарты ATCC
    Первая международная инициатива по созданию RSM для rAAV началась в 2010 году, когда Рабочая группа по эталонных стандартам AAV (AAVRSWG) подготовила первичные RSM для rAAV2, а затем rAAV8 в 2014 году. В эту добровольческую организацию входили члены из пяти промышленных организаций, 13 университетов, Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA), Национального института здравоохранения (NIH) и Фонда биообработки Вильямсбурга (WilBio), представляющих четыре страны: США, Францию, Германию и Японию. Первичные RSM были предназначены для того, чтобы служить стандартами на уровне сообщества для облегчения межлабораторного сравнения доз в неклинических и клинических исследованиях. Исследователей поощряют указывать титры в отношении этого первичного RSM при публикации или подаче данных в органы здравоохранения. Производство было направлено на достижение итогового титра в 1 × 1012 векторных геномов на миллилитр (vg·mL-1) и получение примерно 5 000–10 000 флаконов с 0,5 млкаждая, 19. Материалы были охарактеризованы для титра векторного генома (qPCR), титра частиц (ELISA), трансдукционного титра (флуоресцентная микроскопия), титра инфекционных частиц (TCID 50), чистоты (электрофорез гелья натрия додецилсульфат-полиакриламида (SDS-PAGE)) и идентификации векторов (гель-электрофорез) в ходе многолабораторного исследования с участием 16 лабораторий по всему миру. Кроме того, были оценены микоплазма, бионагрузка, стерильность и эндотоксин для обеспечения безопасности продукции 23,24,25. Подробный обзор аналитической характеристики AAV, включая ключевые анализы и информацию, предоставляемую каждым анализом, представлен в разделе 4.
    Хотя RSM ATCC были пионерами материалов в области AAV, их полезность ограничена тем, что они были произведены более десяти лет назад, до того, как многие современные аналитические подходы к характеристике AAV получили широкое распространение. Например, первоначальная характеристика не включала профилирование пустого или полного капсида, что ограничивает их прямое применение для стандартизации анализа содержания капсида, который сейчас считается важным CQA для rAAV. Кроме того, была отмечена значительная межлабораторная вариабельность для титра генома векторов, титра капсидов и инфекционных титра, несмотря на использование общих протоколов и реагентов, что подчёркивает, что одиночество обычных материалов не гарантирует гармонизированных измерений, а более зрелые анализы с подробными стандартными процедурами также имеют значение. Согласно текущей информации поставщиков, доступность этих материалов также ограничена, что может дополнительно ограничить более широкоевнедрение 11. Согласно текущей информации о продукции поставщика, доступность этих материалов ограничена 3 флаконами на одного клиента в год для AAV2 (ATCC VR-1616), при этом поставка отмечена как ожидающая пополнения, и 12 флаконами на клиента в год для AAV8 (ATCC VR-1816). Эти ограничения неизбежно ограничивают более широкое и рутинное использование этих материалов в виде общеобщественныхRSM 26,27.
  2. Стандарты USP
    Что касается фармакопейных инициатив, USP в настоящее время является единственной организацией, которая подготовила первичные RSM для AAV. Следующие данные характеристики основаны на примечанияхUSP 28, 29, 30. В 2025 году USP выпустила AAV8 RSM для полных и пустых капсидов в попытке стандартизировать аналитику капсидного контента. Для достижения этого USP установила RSM с высокими концентрациями (> титром вирусных частиц 3,0E+12 на миллилитр (vp·mL-1)) и значительными объёмами (300 мкл), что позволило применять их в различных методах анализа содержания капсидов. Было проведено комплексное многолабораторное совместное исследование для полной оценки USP AAV RSM и обеспечения точности и точности измерений. В этом исследовании участвовали пять независимых лабораторий, и использовались несколько методов анализа содержания капсида: AUC, SEC-MALS, CD-MS, MP и UV/VIS. Дополнительные методы биофизической характеристики были применены к образцам AAV, включая картирование пептидов, секвенирование следующего поколения (NGS), dPCR и электрофорез капиллярного геля (CGE), что дало дополнительные данные о характеристике частиц28.
    Кроме того, USP разработала количественное ПЦР-контроль на основе AAV5, содержащее энхансер цитомегаловируса (CMV), куриный β-актин (CBA), зелёный флуоресцентный белок (GFP), сигнал полиаденилирования обезьяньего вируса 40 (SV40), предназначенный для использования в качестве стандартного калибра кривой или анализа контроля при измерении титра генома. Содержание капсида определялось с помощью SEC-MALS, а титр вирусного генома количественно оценивался с помощью dPCR, направленного на несколько последовательностей. Многолабораторное исследование dPCR, включающее 4 лаборатории, показало, что таргетирование SV40 даёт меньшую межлабораторную вариабельность (CV 11,2%) по сравнению с таргетированием ITR (CV 36,1%), вероятно, из-за интерференции вторичной структуры ITR. Следовательно, присвоенное эталонное значение основано на целевом титре SV40 и равно 7 x 1010 vg·mL-1,32. Что касается эталонных материалов для анализов титра капсидов, USP предоставляет референсные материалы для титра капсидов для AAV1, AAV5, AAV8 и AAV9. Эти материалы, характеризующиеся SEC-MALS для абсолютной количественной оценки частиц капсида и варьируются от 1x1011 до 1x1012 vg·mL-1, могут служить стандартными калибрантами кривой или положительными контролями в анализах титра капсида30.
  3. Коммерческие стандарты
    Несколько коммерческих компаний предлагают полные и пустые AAV RSM для нескольких серотипов, например, PROGEN, AAVnergene и Revvity; Следующие данные характеристик и спецификации продукции основаны на информации, предоставленной поставщиками, включая листы продукции и примечанияпо применению 31, 32, 33, 34, 35. В качестве вторичных RSM эти материалы часто сравниваются с РСМ ATCC. По сравнению с фармакопейными RSM, эти RSM охватывают более широкий спектр серотипов, при этом некоторые поставщики поставляют AAV1–13 и инженерные варианты. Коммерческие RSM обычно характеризуются по базовым характеристикам качества, таким как титр капсида (по ELISA или SEC-MALS), титр векторного генома (с помощью qPCR или dPCR) и содержание капсида (часто одним аналитическим методом).
    Однако некоторые из этих коммерческих материалов доступны лишь в небольших количествах, что ограничивает их использование для обширной разработки различных анализов или многоцелевых исследований. Кроме того, отсутствует обширная характеристика в ходе многолабораторного совместного исследования с несколькими ортогональными методами, включая оценку устойчивости, что ограничивает уверенность в присвоенных значениях и межлабораторную применимость. Несмотря на эти ограничения, коммерческие RSM играют важную роль в разработке, валидации и оптимизации процессов и могут служить временными RSM, когда первичные RSM недоступны для конкретных серотипов.
    Некоторые поставщики работают над более строгими протоколами характеристики и повышением прозрачности для повышения полезности своихRSM-предложений 36,37.
  4. Внутренние стандарты
    Отдельные лаборатории также могут разрабатывать собственные RSM — стратегию, часто применяемую для уникальных продуктов AAV, таких как серотипы, созданные на капсуле, или специфические вирусные геномные конструкции. Для снижения затрат также могут быть предпочтительнее собственные RSM, поскольку первичные и коммерческие вторичные справочные материалы могут быть дорогими. Когда это возможно, эти внутренние RSM следует сравнивать с первичными RSM для последующего использования для разработки анализов, валидации, рутинного тестирования во время производства или контроля качества. При использовании внутренних РСМ важны несколько важных факторов: эти материалы должны быть тщательно охарактеризованы, резервироваться достаточное количество и разработать протоколы для контроля стабильности со временем. Кроме того, планирование производства новых партий RSM имеет решающее значение, включая сохранение достаточного количества материалов из предыдущей партии для согласования измерений и обеспечения непрерывности на протяжении всей разработкипродукции 20. В разделе 3 представлен подробный обзор стратегий внутреннего производства RSM, охватывающий процессы вверх и вниз, а также аналитическую характеристику. Вместе эти подходы предоставляют практическую основу для создания внутренних RSM.

3. Стратегии производства RSM:

Производство высокочистых AAV RSM представляет собой врождённые сложности. Достижение 100% пустых капсульных препаратов осложняется тем, что «пустые» капсиды могут содержать остаточный генетический материал. Аналогично, получение чистых препаратов полного капсида затруднено, поскольку пустые и частично заполненные капсиды имеют схожие физические характеристики и совместно очищаются с полными капсидами в процессахразделения 10. Несмотря на эти трудности, значительные достижения в производственных технологиях теперь позволяют обогащать преимущественно полные или преимущественно пустые популяции капсидов. В следующем разделе представлен всесторонний обзор современных технологий производства и разделения, а также методов характеристики и условий формулировки, которые могут использоваться для производства, характеристики и хранения AAV RSM.

  1. Обработка в верхней части
    rAAV, как и другие биотерапевтические средства, должен производиться в живых клетках, чаще всего с использованием транзитной трансфекции или платформ на основе вирусных инфекций. Доминирующий подход к клиническому материалу — тройная плазмидная транфекция в клетках суспензии HEK293, использующая три отдельных плазмиды для трансгена, генов rep/cap и вспомогательных функций; Эта гибкая, свободная от вирусов помощников система поддерживает быструю взаимозаменяемость серотипов и трансгенов и используется для большинства клинических программ и одобренных продуктов38. Однако стоимость плазмидной ДНК значительно увеличивается по мере увеличения производства, что является значительным недостатком. Для снижения стоимости сырья производственные системы были оптимизированы с трёх плазмид до двух (rep/cap/helper гены на одной плазмиде, трансген на другой) или одной (со всеми генами на одной плазмиде)39,40. Клетки HEK293 могут культивироваться в адгерентных или подвесных форматах с сопоставимой производительностью, хотя культура суспензии предпочтительна радимасштабируемости 41.
    Альтернативные производственные платформы включают систему экспрессионного вектора бакуловируса (BEVS) в клетках Sf9 или других насекомых, стабильные линии продуцирующих клеток, системы на основе вируса простого герпеса и индуцируемые экспрессионные системы. Примечается, что разные производственные платформы могут давать существенно разные соотношения пустот/полный даже для одного и того же серотипа, при этом сообщается %full от 8% до более 39% в зависимости от платформы и конкретного использованного серотипаAAV 42.
    Выбор соответствующей производственной платформы и оптимизация условий для генерации RSM требуют тщательного рассмотрения целевой популяции капсидов. Что касается транзиентного трансфекции HEK293, наиболее широко используемой системы производства клинических материалов и доступных в настоящее время RSM (Таблица 1), различные параметры процесса могут быть оптимизированы для повышения как выхода, так и соотношения пустого и полного капсида. Для полных капсидных RSM оптимизация процессов в предыдущем потоке направлена на максимизацию выхода и эффективности упаковки генома, чтобы минимизировать частичное или пустое образование капсидов, поскольку начальное соотношение пустот/полный в сыром лисате напрямую влияет на нижнее соотношение пустот/полный. Ключевые параметры включают плотность клеток при трансфекции, молярные соотношения плазмид, соотношение трансфекционного реагента к ДНК, время сбора, добавки к малым молекулам (например, агенты для остановки клеточного цикла) и дизайн трансгенных кассет 40,43,44,45,46.
    Пустые капсидные RSM обычно получаются путём опуска трансгенной плазмиды во время трансфекции, что предотвращает упаковку ДНК после сборки капсида. На практике, однако, эти «пустые» препараты часто всё ещё содержат загрязняющую ДНК, что делает их состав гетерогенными и подчёркивает необходимость тщательной аналитической характеристики47,48.
  2. Обработка на последующих этапах
    Нижний процесс (DSP) включает сбор, очистку и очистку вектора для получения высокочистого продукта AAV при обеспечении высокого выхода вектора и оптимального соотношения пустот/полный. Обработка по следующей линии начинается через 72 часа после трансфекции с лизисом клеток для восстановления внутриклеточных rAAV49. Хотя вирусный выход варьируется в зависимости от серотипа, лизис клеток обеспечивает полное внутриклеточное восстановление50. Лизис достигается механически с помощью циклов замораживания и оттаивания или химическим путём с использованием буферов на основе моющих средств (например, Triton X-100, Tween-20/80, CHAPS), при этом для улучшения масштабируемости предпочитаются химические методы49,51. Обработка нуклеазой (например, бензоназой) во время лизиса разрушает некапсидированные векторные геномы и загрязняет плазмидную ДНК, предотвращая смещение титрации генома и снижая вязкость ДНК для дальнейших этапов DSP. Распространённый буфер лизиса для rAAV, полученного на основе HEK293, составляет 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,1% тритон X-100, бензоназа 25–50 U.mL-1,51. Затем лизат очищается с помощью глубинной фильтрации или центрифугирования для удаления клеточного мусора. Тангенциальная фильтрация (TFF) затем концентрирует сбор и заменяет буфер для дальнейшей очистки, хотя этот этап можно опустить, если следующий этап очистки может справляться с большими объёмами. Дальнейшая очистка осуществляется с помощью ультрацентрифугирования (UC) или хроматографических методов52.

    Градиентная плотность UC, чаще всего с помощью градиента хлорида цезия (CsCl) или иодиксанол, традиционно применяется для очистки rAAV, обеспечивая высокий выход и эффективное отделение полных капсидов от технологических и продуктовых примесей53. Хотя UC обладает независимостью от серотипов и высокой чистотой, у неё есть значительные недостатки, включая ручное обращение, ограниченную масштабируемость для больших объёмов и трудоёмкую обработку. Колонная хроматография стала предпочтительной альтернативой, обеспечивая масштабируемость, более быстрые сроки обработки и возможности автоматизации, и успешно применялась для клинического производства rAAV и rAAV RSM. Колонная хроматография для rAAV обычно проводится в два последовательных этапа: захват и полировка52,54.

    Аффинитная хроматография служит основным этапом захвата, используя иммобилизованные лиганды на смолах для связывания капсидов AAV при одновременном удалении большинства примесей, связанных с процессом. Фрагменты однодоменных антител (VHH) недавно стали предпочтительным выбором лиганда благодаря универсальности между серотипами и высокой специфичности. Широко используемые столбцы на основе антител включают POROS CaptureSelect AAVX, AVB Sepharose High Performance и Capto AVB51. POROS CaptureSelect AAVX предлагает самую широкую специфичность, связывая AAV1–9, rAAV-10 и инженерные варианты, что делает его подходящим для серотип-независимой очистки55​. Он широко применяется для большинства коммерческих очищений rAAV RSM (Таблица 1). Поскольку столбцы аффинности не могут различать полные и пустые капсиды, поскольку эпитопы присутствуют на обоих вариантах, применяется дополнительный этап полировки. Этап полировки обычно использует хроматографию с анионным обменом (AEX) для разделения полных и пустых капсидов. Этот метод использует небольшую разницу изоэлектрических точек (pI) между полными (~5,9) и пустыми (~6,3) популяциями капсидов52. Коммерчески доступны три формата стационарной фазы: упакованные смолы, монолиты и мембранные колонки53. Сравнительные данные о производительности по всем трём форматам AAV ограничены. Однако монолиты и мембранные колонки поддерживают более высокие конвективные расходы, что делает их предпочтительнее на больших масштабах, где критически необходим сокращение времени обработки. Упакованные смолы зависят от ограниченного диффузионного массопереноса и более высокого обратного давления, что ограничивает расход56,57. Список коммерчески доступных колонок AEX можно найти в обзоре Юнгбауэра и др.51. Для элюции поступенчатые градиенты солей всё чаще предпочитаются по сравнению с неглубокими непрерывными градиентами соли, поскольку фиксированные ступени солей менее чувствительны к инструментальным изменениям (смешивание насосов, скорость расхода), чем постоянно меняющиеся градиенты, что повышает воспроизводимость и снижает расход буфера52. Оптимизированные протоколы AEX позволяют достичь >90% полной чистоты капсида по нескольким серотипам58. Однако, в отличие от UC, AEX пока не продемонстрировал надёжного разделения частично заполненных капсидов, и каждый серотип требует оптимизации, так как профиль заряда варьируется в зависимости от серотипа51. Примечательно, что большинство коммерческих процессов очистки RSM сочетают хроматографию с захватом аффинности с UC (йодиксанол или CsCl) в качестве этапа полировки, используя преимущества высокой чистоты UC после первоначального удаления примесей на основе аффинности (Таблица 1).
  3. Формулировка
    Оптимизация формулировки AAV важна для обеспечения стабильности RSM и его срока годности. Проектирование формулы включает отбор вспомогательных веществ, регуляцию осмолярности, буфер, отбор поверхностно-активного вещества и контроль прочности ионов для минимизации агрегации. Наиболее распространённые буферные системы включают фосфатные, трисфатные, ацетатные, цитратные и лактатные, обычно работающие в диапазоне pH от 7,4 ± 0,3 при различных серотипах. Эксципиенты — это стабилизирующие агенты, часто встречающиеся в AAV-формулах, включая NaCl, KCl, полоксамер 188 (Px188), MgCl₂, CaCl₂, сахарозу, PS20, сорбитол, маннитол, глицерин и человеческий сывороточный альбумин. Px188 при уровне ~0,001% обычно используется для снижения межповерхностного и механического напряжения, что ограничивает разрыв капсида и потерю титра при обработке и заморозке-оттаивании59. Осмолярность — важный критерий для введения на человека, но менее актуальна для исследовательскихRSM 60. Большинство коммерческих RSM используют буферы на базе PBS, иногда дополняемые дополнительными солей. Поставщики рекомендуют хранить при -80 °C и избегать множественных циклов замораживания и оттаивания, так как это может способствовать разрыву капсидов на границах ледяной воды, что потенциально приводит к потеретитра 34,61.

4. Аналитическая характеристика: определение стандарта

После того как RSM был создан, очищен и сформулирован, проводится комплексная аналитическая характеристика. Этот этап обеспечивает качество RSM и его применимость в качестве эталона для различных аналитических методов. Использование ортогональных аналитических методов для оценки одних и тех же характеристик качества особенно важно для обеспечения устойчивости и поэтому настоятельно рекомендуется. Ключевые качества, специфичные для AAV RSM, можно разделить на три категории: титр, идентичность и чистота, как указано в Таблице 2.

  1. Титр
    Характеристика RSM охватывает измерение титра, количественно определяемого как титр векторного генома и титр частиц капсида, предоставляя информацию о количестве присутствующих векторных геномов и капсидов. Титр генома обычно измеряется с помощью qPCR или dPCR, направленных на трансген, ITR или другие элементы трансгенной кассеты, при этом дизайн анализа и размещение праймера/зонда существенно влияют на результаты. Анализы на основе ITR независимы от серотипа и широко применимы, но острые структуры ITR могут затруднять связывание праймеров, и такие анализы могут завышать титры при наличии частично заполненных капсидов с последовательностями ITR; Показано, что ITR-таргетинг qPCR завышел титры генома для РСМ AAV2 и AAV8 по сравнению с анализами на кассетную таргетингэкспрессии 11. Ещё одним источником смещения в qPCR является использование двухцепочечных плазмидных ДНК-калибров, которые демонстрируют другую амплификационную кинетику по сравнению с одноцепочечными rAAVгеномами 29.
    dPCR устраняет оба ограничения через абсолютную количественную оценку с помощью статистики Пуассона, устраняя зависимость от стандартной кривой, и показало, что менее подвержена интерференциям вторичной структурыITR. Примечательно, что qPCR может достигать эквивалентной точности при калибровке с использованием rAAV, а не плазмидного калибра, что предлагает более экономичнуюальтернативу 63. Правильная предобработка образцов не менее важна. Обработка ДНКазой удаляет внешнюю ДНК, чтобы обеспечить количественную оценку только инкапсулированных геномов, и должна сопровождаться инактивацией до нарушения капсида с использованием протеиназы K или термическойобработки 64,65,66. Оптимизированный и валидированный протокол количественной оценки генома на основе ddPCR в очищенных векторных образцах был опубликован нашей исследовательскойгруппой 67.
    Титр частиц капсидов обычно определяется с помощью ELISA или SEC-MALS. ELISA обладает высокой специфичностью и устойчивостью к эффектам матрицы, но является специфическим для серотипа, стандартной кривой и трудоёмким. SEC-MALS независим от серотипа и быстрее, но требует специализированнойинструментальной системы 22.
  2. Идентичность
    Оценка идентичности направлена на подтверждение того, что полученный AAV соответствует предполагаемому серотипу и геномной последовательности, исключая непреднамеренные изменения как на уровне белка, так и на уровне ДНК. Идентичность белка капсидов относится к определению серотипа. Распространённые методы включают ELISA и western blot (WB) с использованием серотип-специфических антител. В последнее время масс-спектрометрия в сочетании с высокопроизводительной жидкостной хроматографией (LC-MS) стала более высокого порядка, комплементарный подход для идентификации серотипов и анализа состава капсидов благодаря высокой воспроизводимости, точности и устойчивости, хотя обычно не применяется для рутинной внутренней характеристикиRSM 6,22. Идентичность векторного генома может быть оценена с помощью методов секвенирования, таких как секвенирование нанопор. Этот подход обеспечивает длительное покрытие полных геномов AAV, позволяя точно определить идентичностьпоследовательности 22.
  3. Чистота
    Третий важный параметр качества для AAV RSM — это чистота, охватывающая чистоту белка, целостность капсидов и генома, содержание капсидов и агрегацию. Целостность капсида оценивается путём проверки стехиометрии VP (VP1:VP2:VP3 ≈ 1:1:10) с использованием электрофореза гель-натрия додецилсульфат-полиакриламида (SDS-PAGE), капиллярного электрофореза натрия додецилсульфата (CE-SDS) или WB, при этом WB дополнительно подтверждает идентификацию белкакапсида 22.
    Целостность генома, независимо от того, является ли трансген полноразмерным или усечённым, может быть оценена с помощью агарозного геля электрофореза (AGE), мультиплексного ddPCR или методов секвенирования, таких как секвенирование нанопор. Хотя AGE понятен, он предлагает ограниченное разрешение и специфику. Мультиплексная ddPCR предоставляет количественные, регионально-специфические данные, которые гелевые методы не могут сделать, хотя и ценой более масштабной разработкианализов 22,68.
    Содержание капсулы часто оценивается делением титра генома на титр капсида; однако это зависит от двух независимых анализов, которые могут вводить дополнительную изменчивость и поэтому не рекомендуется для характеристики RSM. Более подходящие методы для этой характеристики с меньшей вариабельностью включают AUC, SEC-MALS, MP, CD-MS и UV/Vis 8,69,70,71,72,73. Недавние достижения ещё больше повысили ценность AUC и SEC-MALS как методов с несколькими атрибутами. В частности, многоволновой AUC (MWL-AUC) позволяет не только различать пустые, частично заполненные и полные капсиды, но и оценивать титр генома, титр капсидов иагрегацию 71,74. Аналогично, SEC-MALS может предоставить в рамках одного анализа информацию о титре капсида, титре генома, чистоте, агрегации и соотношении полного к пустомукапсиду — 73,75. Агрегацию также можно контролировать с помощью динамического рассеяния света (DLS). Примечательно, что только AUC, MP и CDMS традиционно предлагали достаточное разрешение для количественной оценки частично заполненных капсидов. Однако недавно был разработан усовершенствованный метод TEM, который также позволяет точно количественно измерять частично заполненные капсиды по сравнению с SV-AUC и MP76. Поскольку ни один метод не стал золотым стандартом содержания капсидов, а эти методы опираются на разные аналитические принципы, рекомендуется использовать несколько взаимодополняющих подходов для всесторонней оценки общейчистоты 10.
  4. Стабильность
    Долгосрочная стабильность критически важна для RSM, поскольку эталонные значения должны оставаться постоянными для обеспечения надёжной калибровки со временем. AAV RSM обычно хранятся при ≤-70 °C для поддержания целостности капсида и генома. Многолабораторное исследование устойчивости AAV8 RSM (ATCC VR-1816) показало стабильный титр векторного генома, инфекционного титра и титра капсидов не менее двух лет при < -70 °C 77. Процедуры тестирования устойчивости могут соответствовать рекомендациям ICH Q1A, оценивая ключевые характеристики с определёнными интервалами: каждые 3 месяца (год 1), каждые 6 месяцев (год 2) и ежегодно 78 раз. Краткосрочная стабильность при ускоренных условиях хранения (2–8 °C) обычно оценивается через 1, 2 и 4недели 79. Критические показатели стабильности включают титр генома, титр капсида, содержание капсида, целостность белка капсида и агрегацию. РСМ также следует оценивать на чувствительность к заморозкеи оттаиванию 80.

5. Гармонизированные СОП как второй столп аналитической стандартизации AAV

Помимо доступности хорошо охарактеризованных RSM, значимая стандартизация в аналитике AAV также требует гармонизированных и достаточно детальных стандартных процедур. Даже при применении одного и того же аналитического метода результаты могут существенно различаться в разных лабораториях из-за различий в предварительной обработке образцов, настройках инструмента, стратегии калибровки, обработке данных и критериях интерпретации — факторах, которые, как показано, способствуют межлабораторной изменчивости независимо от самой аналитическойплатформы 8,9.

Это иллюстрируется совместным межлабораторным исследованием NIST, Национального института инноваций в производстве биофармацевтики (NIIMBL) и USP, в ходе которого шесть лабораторий оценивали одни и те же образцы AAV5 и AAV8 на содержание капсидов четырьмя методами. Оптические методы, включая SEC-MALS и UV/VIS, показали самое сильное межлабораторное согласование, тогда как PCR-ELISA показали низкую воспроизводимость и считались непригодными для количественного использования без дальнейшей гармонизации. Несмотря на широкое признание метода золотого стандарта, SV-AUC демонстрировал большую межлабораторную вариабельность, чем SEC-MALS, и последующие усилия по разработке стандартизированных процедур SV-AUC были определены как важный следующийшаг 8,81.

Похожий вывод был достигнут и для определения титра генома с помощью dPCR, где предварительная обработка образцов, стратегия экстракции, платформа прибора, условия разбавления, время лизиса капсидов и история заморозки-оттаивания могут влиять на представленные значения. Важно отметить, что более строгий процедурный контроль значительно снижает вариабельность, что ещё больше подчёркивает ценность гармонизированныхSOPs 9.

Поэтому RSM и SOPs следует рассматривать как дополняющие столпы аналитической стандартизации AAV. RSM обеспечивают якорь измерения, необходимый для прослеживаемости и калибровки, тогда как SOPs снижают процедурную вариабельность и помогают обеспечить последовательное воспроизведение назначенных значений в аналитиках, приборах и лабораториях.

Выводы

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rAAV-генная терапия развивается быстрее, чем способность отрасли стабильно определять качественные характеристики. Этот обзор показывает, что основным препятствием для сопоставимой характеристики AAV является не отсутствие аналитических инструментов, а отсутствие общих якорей измерений и гармонизированных рабочих процессов. РСМ решают эту проблему, преобразуя метод-зависимые измерения в прослеживаемые, сопоставимые значения. RSM позволяют валидировать методы, улучшать межлабораторную воспроизводимость и обеспечивать постоянный контроль для обнаружения дрейфа анализов. Однако производство высококачественных AAV RSM остаётся технически сложным из-за сложности получения чисто пустых и полных капсидных популяций, необходимости комплексной ортогональной характеристики и необходимости долгосрочной стабильности при определённых условиях хранения. Недавние достижения в производстве и технологиях очистки позволили производить преимущественно пустые и полные капсидные препараты, которые могут использоваться для создания собственных РСМ, а текущие предложения от фармакопейных организаций (USP), совместных консорциумов (ATCC) и коммерческих поставщиков представляют собой значимый прогресс. Однако разработка универсальных AAV RSM фундаментально ограничена разнообразием серотипов, векторных геномов и всё чаще инженерных вариантов капсидов. В отличие от моноклональных антител, гетерогенность AAV требует серотип-специфических и прикладно-специфичных RSM. Эта сложность дополнительно усиливается гибридными и/или инженерными капсидами, которые требуют от разработчиков поддерживать собственные внутренние первичные RSM, тем самым фрагментируя ландшафт измерений. Кроме того, другие атрибуты качества, такие как посттрансляционные модификации (PTM), были выделены как потенциальные CQA и не имеют хорошо охарактеризованных RSM для PTM, что создаёт критический разрыв в понимании этого векторного атрибута. Помимо доступности RSM, гармонизированные стандартные процедуры (SOP) не менее важны. Область выиграла бы от компендиальных методов — стандартизированных, подробных протоколов, опубликованных фармакопеевыми организациями — которые обеспечивают во всех лабораториях последовательное и контролируемое тестирование для AAV CQA. Письменные инструкции, описывающие лучшие практики для широко используемых методов, дополнительно сократят межлабораторные вариации и гармонизируют аналитические рабочие процессы. Создавая отслеживаемые RSM измерения AAV и внедряя последовательные, точные практики характеризации, сообщество может укрепить научную основу, связывающую CQA с безопасностью и эффективностью, поддерживать уверенное принятие регуляторных решений и, в конечном итоге, предоставлять пациентам более безопасные и надёжные генные терапии.

Таблица 1: В настоящее время доступные rAAV RSM и их характеристики

В этой таблице представлены доступные материалы эталонных стандартов rAAV и их ключевые характеристики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Рекомендуемый набор аналитических методов для внутренней характеристики RSM

В этой таблице представлены аналитические методы, рекомендованные для внутренней характеристики RSM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что конфликты интересов не возникают

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект получил финансирование от Рамочной программы исследований и инноваций Европейского союза, Horizon Europe, в рамках Грантового соглашения No 101119880. Этот проект был профинансирован субсидией «Устойчивость Фландрии» от правительства Фландрии, исходящей из «Европейского фонда восстановления и устойчивости» (RRF) (VV021/13).

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33:2479–2516.
  2. Meier AF, Fraefel C, Seyffert M. The interplay between adeno-associated virus and its helper viruses. Viruses. 2020;12. doi:10.3390/V12060662.
  3. Henckaerts E, Linden RM. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virol. 2010;5:555–574.
  4. Wang JH, Gessler DJ, Zhan W, Gallagher TL, Gao G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 2024;9. doi:10.1038/s41392-024-01780-w.
  5. Suarez-Amaran L, Song L, Tretiakova AP, Mikhail SA, Samulski RJ. AAV vector development, back to the future. Mol Ther. 2025. doi:10.1016/j.ymthe.2025.03.064.
  6. Gimpel AL, et al. Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021;20:740–754.
  7. Maruno T, et al. Variation of VP2 stoichiometry and deamidation of VP1 during production and their impacts on the transduction efficiency of AAV vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33:101581.
  8. Lehman SE, et al. Interlaboratory measurement of adeno-associated virus: comparative quantification of full and empty capsids. Hum Gene Ther. 2024. doi:10.1089/hum.2024.124.
  9. Wang G, et al. Assessment of key factors impacting variability in AAV vector genome titration by digital PCR. Int J Mol Sci. 2024;25:5149.
  10. Beattie S, et al. Biophorum: an industry perspective on understanding AAV capsid content variants [white paper]. 2023. doi:10.46220/2023DG001.
  11. D’Costa S, et al. Practical utilization of recombinant AAV vector reference standards: focus on vector genomes titration by free ITR qPCR. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016;3:16019.
  12. Tate J, Panteghini M. Standardisation-the theory and the practice. Clin Biochem Rev. 2007;28:93–96.
  13. Green EA, Lee KH. Analytical methods to characterize recombinant adeno-associated virus vectors and the benefit of standardization and reference materials. Curr Opin Biotechnol. 2021;71:65–76.
  14. Mire-Sluis A, Ritter N, Cherney B, Schmalzing D, Blümel M. Reference standards for therapeutic proteins current regulatory and scientific best practices and remaining needs, part 1. Bioprocess Int. 2014;12:26–36.
  15. United States Pharmacopeia. Reference standard development: from cradle to catalog [Internet]. Available from: https://www.usp.org/sites/default/files/usp/document/our-work/reference-standards/usp-rs-cradle-to-catalog.pdf. Accessed 19 May 2026.
  16. Blaszczyk AJ. New AAV reference standards to aid CQA assessment [Internet]. 2025. Available from: https://www.cellandgene.com/doc/new-aav-reference-standards-to-aid-cqa-assessment-0001. Accessed 22 Jul 2025.
  17. Gavin DK. FDA statement regarding the use of adeno-associated virus reference standard materials. Hum Gene Ther Methods. 2015;26:3.
  18. European Medicines Agency (EMA). Reflection paper on quality, non-clinical and clinical issues related to the development of recombinant adeno-associated viral vectors [Internet]. 2010. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/draft-reflection-paper-quality-non-clinical-and-clinical-issues-relating-specifically-recombinant-adeno-associated-viral-vectors_en.pdf. Accessed 31 Jan 2026.
  19. Flotte TR, Burd P, Snyder RO. Utility of a recombinant adeno-associated viral vector reference standard. BioProcess J. 2002;1(3):75–77.
  20. FDA, CBER. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs): guidance for industry [Internet]. 2020. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigational-new-drug. Accessed 19 May 2026.
  21. Fuentes C, Staudhammer J, Wright JF, Paulk N, Cross S. Dark Horse Consulting Group: beyond empty and full: understanding heterogeneity in rAAV products and impurities. 2023. Available from: https://www.darkhorseconsultinggroup.com/post/heterogeneity-in-raav-vector-genomes-etc. Accessed 19 May 2026.
  22. Kontogiannis T, et al. Characterization of AAV vectors: a review of analytical techniques and critical quality attributes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2024;32. doi:10.1016/j.omtm.2024.101309.
  23. Lock M, et al. Characterization of a recombinant adeno-associated virus type 2 reference standard material. Hum Gene Ther. 2010;21:1273–1285.
  24. Ayuso E, et al. Manufacturing and characterization of a recombinant adeno-associated virus type 8 reference standard material. Hum Gene Ther. 2014;25:977.
  25. Snyder, et al. Manufacture and stability study of the recombinant adeno-associated virus serotype 2 vector reference standard. BioProcessing Journal Trends and Developments in BioProcess Technology. 2008;7:8–14.
  26. ATCC. Recombinant adeno-associated virus 2 VR-1616 TM [product sheet on the Internet]. Available from: https://www.atcc.org/products/vr-1616. Accessed 22 Apr 2026.
  27. ATCC. Recombinant adeno-associated virus 8, VR-1816TM [product sheet on the Internet]. Available from: https://www.atcc.org/products/vr-1816. Accessed 22 Apr 2026.
  28. United States Pharmacopeia. AAV8 reference standards: revolutionizing empty/full capsid analysis [application note]. 2025. Available from: https://www.usp.org/biologics/aav. Accessed 26 Jan 2026.
  29. United States Pharmacopeia. Reference material to accurately measure genome titers of AAV gene therapy products. 2025. Available from: https://www.usp.org/biologics/aav. Accessed 26 Jan 2026.
  30. United States Pharmacopeia. Improving accuracy and precision of AAV ELISA measurements using USP AAV capsid titer analytical reference material [application note]. 2025. Available from: https://www.usp.org/biologics/aav. Accessed 26 Jan 2026.
  31. Revvity. AAV reference standards. Available from: https://www.revvity.com/be-en/category/aav-reference-standards. Accessed 26 Jan 2026.
  32. AAVnerGene. AAV references [Internet]. Available from: https://aavnergene.com/aav-products/aav-references/. Accessed 26 Jan 2026.
  33. Progen. Empty capsids. Available from: https://www.progen.com/Products/AAV/AAV-Standards/Empty-Capsids/. Accessed 9 Feb 2026.
  34. Progen. Standard material (eGFP). Available from: https://www.progen.com/Products/AAV/AAV-Standards/Standard-Material-eGFP/. Accessed 22 Jan 2026.
  35. Progen. Standard material (Rluc). Available from: https://www.progen.com/Products/AAV/AAV-Standards/Standard-Material-Rluc/. Accessed 9 Feb 2026.
  36. Mutz L, et al. Determination of full:empty ratio of AAV standard material by orthogonal methods [poster]. Presented at: European Society of Cell and Gene Therapy; Rome; 2024. Available from: www.progen.com.
  37. Sybre, et al. AAV capsid titer determination of AAV standard material by orthogonal methods. Presented at: European Society of Cell and Gene Therapy; Rome; 2024.
  38. Shen W, Liu S, Ou L. rAAV immunogenicity, toxicity, and durability in 255 clinical trials: a meta-analysis. Front Immunol. 2022;13. doi:10.3389/fimmu.2022.1001263.
  39. Moreno Velasquez SD, Gerstmann E, Grimm D. Goody two plasmids: an optimized transient transfection system for AAV vector production. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023;30:191–193.
  40. Yang R, et al. AAVone: a cost-effective, single-plasmid solution for efficient AAV production with reduced DNA impurities. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36. doi:10.1016/j.omtn.2025.102563.
  41. Baghirzade R. Adherent versus suspension based platforms: what is the near future of viral vector manufacturing? Cell Gene Ther Insights. 2021;7:1365–1371.
  42. Käsbach J, Magnus J. A clinician’s guide to AAV production – how manufacturing platforms shape vector properties. Medizinische Genetik. 2025;37:169.
  43. Xie J, et al. Short DNA hairpins compromise recombinant adeno-associated virus genome homogeneity. Mol Ther. 2017;25:1363–1374.
  44. Fisher K, et al. Polo-like kinase inhibitors increase AAV production by halting cell cycle progression. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33. doi:10.1016/j.omtm.2025.101412.
  45. Andaluz A, et al. Accelerated adeno-associated virus upstream process development from high-throughput systems to clinical scale. Biotechnol Bioeng. 2025. doi:10.1002/bit.70052.
  46. Pistek M, Andorfer P, Grabherr R, Kraus B, Hernandez Bort JA. Factors affecting rAAV titers during triple-plasmid transient transfection in HEK-293 cells. Biotechnol Lett. 2024. doi:10.1007/s10529-024-03520-0.
  47. Ebberink EHTM, Ruisinger A, Nuebel M, Thomann M, Heck AJR. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022;27:491–501.
  48. Richter K, et al. Purity and DNA content of AAV capsids assessed by analytical ultracentrifugation and orthogonal biophysical techniques. Eur J Pharm Biopharm. 2023;189:68–83.
  49. Clément N, Grieger JC. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors for clinical trials. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016;3:16002.
  50. Elmore ZC, et al. The membrane associated accessory protein is an adeno-associated viral egress factor. Nat Commun. 2021;12. doi:10.1038/S41467-021-26485-4.
  51. Jungbauer A, Wheelwright S. Downstream processing of AAV based gene therapy vectors. Sep Purif Technol. 2025;368. doi:10.1016/j.seppur.2025.133051.
  52. Lorek JK, Madelène L, Nilsson B. Chromatography in downstream processing of recombinant adeno-associated viruses: a review of current and future practises. Biotechnol Bioeng. 2025. doi:10.1002/bit.28932.
  53. Dobrowsky T, Gianni D, Pieracci J, Suh J. AAV manufacturing for clinical use: insights on current challenges from the upstream process perspective. Curr Opin Biomed Eng. 2021;20:100353.
  54. Duzenli OF, Aslanidi G. Consecutive affinity and ion-exchange chromatography for AAV9 vectors purification. Biomedicines. 2025;13:361.
  55. Florea M, et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023;28:146–159.
  56. Miklavčič R, et al. Development and validation of AAV capsids separation on specimen columns for reproducibility evaluation of large-scale chromatographic monoliths. J Sep Sci. 2025;48:e70114.
  57. Huato Hernandez J, Boenning K, Kavara A, Schofield M. Membrane chromatography for AAV full capsid enrichment: process development to scale up. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2024;1244. doi:10.1016/j.jchromb.2024.124258.
  58. Bogdanovic A, Donohue N, Glennon B, McDonnell S, Whelan J. Towards a platform chromatography purification process for adeno-associated virus (AAV). Biotechnol J. 2025;20. doi:10.1002/biot.202400526.
  59. Grossen P, Skaripa Koukelli I, van Haasteren J, Machado AHE, Dürr C. The ice age – a review on formulation of adeno-associated virus therapeutics. Eur J Pharm Biopharm. 2023;190:1–23.
  60. Wang W. Tolerability of hypertonic injectables. Int J Pharm. 2015;490:308–315.
  61. Bee JS, et al. Mechanistic studies and formulation mitigations of adeno-associated virus capsid rupture during freezing and thawing: mechanisms of freeze/thaw induced AAV rupture. J Pharm Sci. 2022;111:1868–1878.
  62. Furuta-Hanawa B, Yamaguchi T, Uchida E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther Methods. 2019;30:127–136.
  63. Wang Y, Menon N, Shen S, Feschenko M, Bergelson S. A qPCR method for AAV genome titer with ddPCR-level of accuracy and precision. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020;19:341.
  64. Zin EA, et al. Impact of DNase digestion on titer measurements of engineered adeno-associated virus serotypes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33. doi:10.1016/j.omtm.2025.101419.
  65. Prantner A, Maar D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 2023;18. doi:10.1371/journal.pone.0280242.
  66. Dobnik D, et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front Microbiol. 2019;10. doi:10.3389/fmicb.2019.01570.
  67. Van den Berghe N, et al. Quantification of adeno-associated viral genomes in purified vector samples by digital droplet polymerase chain reaction. J Vis Exp. 2024;2024(October). doi:10.3791/67252.
  68. Duong T, Firmo M, Li CT, Gu B, Wang P. Three-dimensional linkage analysis with digital PCR for genome integrity and identity of recombinant adeno-associated virus. Sci Rep. 2025;15:2154.
  69. Wagner C, Fuchsberger FF, Innthaler B, Lemmerer M, Birner-Gruenberger R. Quantification of empty, partially filled and full adeno-associated virus vectors using mass photometry. Int J Mol Sci. 2023;24. doi:10.3390/ijms241311033.
  70. Ferraiolo J, Chen Y. A case study on streamlining AAV titer determination using variable pathlength technology. Cell Gene Ther Insights. 2022;8:1099–1111.
  71. Maruno T, Ishii K, Torisu T, Uchiyama S. Size distribution analysis of the adeno-associated virus vector by the c(s) analysis of band sedimentation analytical ultracentrifugation with multiwavelength detection. J Pharm Sci. 2023;112:937–946.
  72. Nakatsuka R, et al. Multimass analysis of adeno-associated virus vectors by Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. Anal Chem. 2024;96:17037–17046.
  73. McIntosh NL, et al. Comprehensive characterization and quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light scattering. Sci Rep. 2021;11. doi:10.1038/s41598-021-82599-1.
  74. Bepperling A, Best J. Comparison of three AUC techniques for the determination of the loading status and capsid titer of AAVs. Eur Biophys J. 2023;52:401–413.
  75. Mulagapati SHR, et al. Size-exclusion chromatography as a multi-attribute method for process and product characterization of adeno-associated virus. Mol Ther Methods Clin Dev. 2024;32:101382.
  76. Campos M, et al. Orthogonal approaches to AAV vector characterization: validating quantitative TEM for partially filled particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33. doi:10.1016/j.omtm.2025.101530.
  77. Penaud-Budloo M, et al. Stability of the adeno-associated virus 8 reference standard material. Gene Ther. 2019;26:211–215.
  78. ICH Topic Q1A (R2). Stability testing of new drug substances and products step 5: note for guidance on stability testing: stability testing of new drug substances and products [Internet]. 2003. Available from: http://www.emea.eu.int. Accessed 3 Feb 2026.
  79. Sands L, Lee M, Phillippi M, Debauve G. Minimizing the impact of stability testing on gene therapy batch yield. 2023. doi:10.46220/2023CGT010.
  80. Lengler J, et al. Crucial aspects for maintaining rAAV stability. Sci Rep. 2024;14:27685.
  81. Lehman SE, et al. Study highlights need for standardized measurement methods in gene therapy. Hum Gene Ther. 2025;36:36–44.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233

Похожие статьи