Высокопроизводительный скрининг мутантов Bacillus coagulans, гиперпродуцирующих L-молочную кислоту, с использованием автоматизированной микрофлюидной платформы с каплями

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой стандартный высокопроизводительный рабочий процесс скрининга промышленных микроорганизмов. Он включает создание библиотеки мутантов с помощью мутагенеза ARTP, проведение положительного скрининга капель с помощью автоматизированных микрофлюидиков и последующую проверку результатов. Надёжность рабочего процесса была подтверждена отбором высокопродуктивных штаммов B. coagulans .

Аннотация

Промышленное биопроизводство зависит от микроорганизмов для эффективного синтеза целевых продуктов в инженерных условиях. Однако дикие штамы часто не способны это делать из-за своих естественных метаболических сетей. Поэтому быстрый и точный скрининг высокопроизводительных штаммов из крупномасштабных мутантных библиотек является критически важным этапом в промышленном разведении микробов. В последние годы технология капельной микрофлюидной технологии привлекла значительное внимание благодаря высокой пропускной способности, низкому потреблению и возможностям отделения отдельных клеток, что привело к разработке множества систем сортировки с одной ячейкой. В этом исследовании представлен высокопроизводительный протокол скрининга промышленных микробных штаммов с использованием автоматизированной микрофлюидной платформы с каплями. Интегрированный рабочий процесс состоит из четырёх ключевых этапов: создание библиотеки мутантов с помощью мутагенеза атмосферной и комнатной температуры плазмы (ARTP); высокоэффективное инкапсулирование одной клетки и контролируемое микрокультивирование внутри капель масштаба пиколитра; точная пико-инъекция флуоресцентного биосенсора, затем флуоресцентно-активированная сортировка капель (FADS) для выделения капель с высокопродуктивными вариантами; а также валидация отсортированных кандидатных штаммов с помощью микропластины и встряхивающей ферментации. Полный и интегрированный процесс скрининга предназначен как стандартизированный шаблон, а его валидация демонстрируется выделением высокопродуктивных L-молочнокислотных мутантов B. coagulans , как конкретного примера. Эта автоматизированная, высокопроизводительная платформа скрининга предлагает мощное техническое решение с значительным потенциалом для ускорения промышленного производства высокопроизводительных штаммов.

Введение

Промышленная биотехнология использует микроорганизмы и ферменты в качестве биокатализаторов для производства ценных продуктов в больших масштабах. Этот подход считается более экологичным и эффективным, чем традиционное химическое производство. Однако естественные метаболические сети микроорганизмов эволюционировали так, чтобы ставить на первое место собственное выживание и размножение, а не на эффективный синтез продуктов, желаемых человеком. В результате для удовлетворения потребностей промышленных производственных условий с жёсткими условиями часто требуется высокопроизводительное селекционирование микробов^. Этот процесс включает быстрое создание крупномасштабных микробных мутант-библиотек посредством физического или химического мутагенеза, за которым следует культивирование и фенотипическое обнаружение мутантов с уникальными генотипами. Тогда выбирается лишь небольшая часть высших штаммов. Однако традиционные технологии скрининга на пластинах и микропластинах затруднены громоздкими процедурами, низкой пропускной способностью и высокой стоимостью. Это узкое место, а также значительное потребление расходных материалов и реагентов, приводит к низкой общей эффективности микробной^{селекции 4,5}.

Микрофлюидика с капельными технологиями недавно стала преобразующим решением этой задачи. В отличие от флуоресцентно-активированного сортировки клеток (FACS), которое плохо подходит для скрининга секретируемых продуктов из-за быстрой диффузии молекул вдали от клетки, флуоресцентно-активированное сортировка капель (FADS) инкапсулирует отдельные клетки в пиколитеровых, компартментированных^{микрореакторах 6,7,8}. Эта физическая изоляция предотвращает конкуренцию штаммов, позволяет локализованно накапливать секретируемые метаболиты и позволяет их количественно обнаруживать с помощью флуоресцентных биосенсоров. В результате FADS доказал свою эффективность как идеальная платформа для высокопроизводительного скрининга различных внеклеточных продуктов, включая аминокислоты, органические кислоты и ферменты. Команда разработала генетически закодированный флуоресцентный биосенсор GECFINDER и в сочетании с FADS успешно скринировала штаммы, производящие высоко фенилаланин, и повысила эффективность скрининга более чем в 1000^{раз 9}. Другая группа создала платформу сортировки капель с флуоресценцией, в сочетании с генетически закодированным биосенсором для высокопроизводительного скрининга 3-дегидрошикимовых кислотных штаммов E. coli, а оптимизированная система FADS значительно повысила эффективность скрининга и позволила выделить мутантные штаммы с существенно увеличенной^{продукцией 10}. Некоторые исследователи применили технологию FADS к разработке Bst-полимеразы ДНК, и приобретённые мутанты с значительно повышенной термостабильностью и активностью смещения цепочек были дополнительно применены для обнаружения LAMP, что сократило время реакции с 40 минут до 10^{минут 11}.

Однако преобразование этих технологических достижений в рутинные рабочие процессы разработки промышленных штамнов остаётся сложным. Многие коммерческие капельно-флюидные системы, несмотря на сложное оборудование, не имеют полной, интуитивной и воспроизводимой стандартной операционной процедуры, адаптированной для микробного фенотипического скрининга. Для устранения этого пробела была принята автоматизированная капельно-микрофлюидная платформа, интегрирующая модульное гидрожидкое управление, удобное программное обеспечение и стандартизированное проектирование чипа, что заложило идеальную техническую основу для создания полностью интегрированного рабочего процесса скрининга. В этом исследовании используется высокопроизводительный скрининг высокопродуктивных B. coagulans , производящих L-молочную кислоту, в качестве валидационного случая. На основе микрофлюидической платформы с каплями был создан следующий рабочий процесс, состоящий из четырёх ключевых последовательных этапов: (1) создание разнообразной библиотеки мутантов с помощью мутагенеза атмосферной и комнатной температуры плазмы (ARTP); (2) высокоэффективная инкапсуляция одной клетки и контролируемое микрокультивирование внутри капель в условиях, оптимизированных для роста B. coagulans и производства L-молочной кислоты; (3) точная пико-инъекция L-лактатно-специфического флуоресцентного биосенсора, затем быстрое сортирование капель, инкапсулирующих превосходящих производителей; и (4) строгую валидацию отсортированных кандидатов посредством ферментации с помощью встряхивающей фляжки для подтверждения повышенной продуктивности и генетической стабильности. Этот протокол предназначен для исследователей и инженеров, занимающихся промышленным микробным разведением и нуждающимся в высокопроизводительном скрининге внеклеточных продуктов. Особенно подходит для культивируемых бактерий, выделяющих мелкомолекулярные метаболиты или ферменты. Скрининговая платформа должна быть оснащена датчиками, совместимыми с микроокружением капель для обеспечения конкретного обнаружения целевых метаболитов. Для штаммов с особыми требованиями к культивации (например, строгие анаэробы) параметры культивации могут быть адаптированы для оптимизации и создания специализированной стратегии культивирования. Создавая этот замкнутый, стандартизированный процесс скрининга, это исследование направлено на предоставление мощного и универсального решения для ускорения промышленного разведения штаммов.

Протокол

Этическое одобрение для этого исследования не требовалось. Все эксперименты проводились с использованием чисто микробных культур, и в исследованиях не участвовали ни люди, ни лабораторные животные. См. Таблицу материалов для получения подробностей обо всех материалах, используемых в следующем протоколе.

1. Подготовка

ВНИМАНИЕ: Соблюдайте правила биобезопасности. B. coagulans — это организм первого уровня биобезопасности. Наденьте перчатки и лабораторный халат. Выполняйте все открытые манипуляции внутри ламинарного потока. Автоклавуйте все материалы, контактирующие с живыми элементами при 121 °C, в течение 20 минут до утилизации.

1. Источник деформации и обслуживание
   1. Приобретите B. coagulans ATCC 7050 в коммерческом центре сбора культуры как культуру второго поколения.
   2. Нанесите петлю наклонной культуры на средний агар и инкубуйте при 50 °C в течение 24 часов. Выберите одну колонию, инокулируйте её в жидкую семянную среду и выращите при температуре 50 °C, 200 об/мин в течение 12 часов.
   3. Смешайте полученную культуру со стерильным 40% глицерином до конечной концентрации 25% (v/v) и храните в замороженном виде при -80 °C. Для каждого эксперимента размораживайте свежий аликвот, наносите его на средний агар и инкубируете при 50 °C в течение 24 часов.
   4. Затем выберите одну колонию, инокулируйте её в жидкую семянную среду и культивируйте при температуре 50 °C, 200 об/мин в течение 12 часов, прежде чем использовать для мутагенеза и скрининга (дополнительный рисунок 1).
2. Датчик молочной кислоты
   1. Экспрессировать и очистить датчик eLACCO1.1, как описано в Дополнительных^{материалах 12} (Дополнительный рисунок 2).
   2. Дополните очищенный датчик 5% (v/v) глицерином и храните при -80 °C. Для каждого эксперимента размораживайте одну аликвоту на льде и немедленно разведите его стерильным 10 мМ PBS (pH 7,4) до конечной рабочей концентрации 0,1 мг/мл.
3. Подготовка культурных медиа
   1. Среда семени (г/л: глюкоза 20, экстракт дрожжей 5, триптон 10, ацетат натрия 2, цитрат натрия 2, K₂HPO₄ 2, MgSO₄·7H₂O 0,2, MnSO₄· H₂O 0,05, FeSO₄·7H₂O 0,01). Стерилизуйте глюкозу отдельно в булье 200 г/л при 115 °C в течение 20 минут.
      1. Автоклав оставшихся компонентов при 121 °C в течение 15 минут. После охлаждения добавьте стерильный глюкозный бульон до конечной концентрации 20 г/л, затем фильтруйте и стерилизуйте микроэлементы.
      2. Храните весь материал при 4 °C до недели. Используйте для ночной активации, подготовки инокуля.
   2. Среда скрининга (г/л: глюкоза 20, экстракт дрожжей 6,66, NaCl 0,333,_{NH 4}Cl 0,665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4,46, MgSO₄ 0,12, CaCl₂ 0,074).
      1. Стерилизуйте глюкозу отдельно при 115 °C в течение 20 минут. Автоклавировать смесь экстракта соли и дрожжей при 121 °C в течение 15 минут.
      2. После охлаждения добавьте стерильный глюкозный бульон до 20 г/л. Храните при 4 °C до недели. Используйте как водную фазу для образования капель и как культурную среду внутри капель во время 10-часовой инкубации.
   3. Среда ферментации (г/л: глюкоза 90, триптон 13,33, экстракт дрожжей 13,33, ацетат натрия 0,67, NaCl 0,0133, MgSO₄·7H₂O 0,0133, MnSO₄· H₂O 0,0133,_{FeSO 4,7H 2}O 0,0133).
      1. Стерилизуйте глюкозу в виде бульона по 500 г/л при 115 °C в течение 20 минут. Автоклав остальных компонентов на 121 °C в течение 15 минут.
      2. После охлаждения добавьте стерильный глюкозный бульон до 90 г/л. Добавьте стерильный порошок_{CaCO 3} (4% в/в) непосредственно перед инокуляцией для буферизации pH. Готовьте свежие каждый день. Используйте для первичного скрининга микропластин и валидации встряхивающей фляжки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все слои с дистиллированной водой до конечного объёма 1 л. Отрегулируйте pH до 6,5 с 1 M HCl.

2. Создание мутантной библиотеки с использованием ARTP

ВНИМАНИЕ: Работа ARTP включает высокочастотную плазму и ультрафиолетовую лампу. УФ-излучение может привести к повреждению глаз и кожи. Плазменный разряд образует озон и высокие температуры. Всегда держите дверцу камеры закрытой, пока плазма включена. Наденьте лабораторный халат и очки, блокирующие ультрафиолет. Используйте только 99,999% чистого гелия; обеспечьте адекватную вентиляцию. После каждой операции мутагенеза протирайте верстак и внутренние стенки камеры мутагенеза безворсовой тканью, обмакнутой в этанол 75% (v/v). 75% этанола очень воспламеняющийся. Избегайте открытого огня, искр и горячих поверхностей.

1. Установите стандартную кривую, коррелирующую_{OD 600} с жизнеспособной концентрацией клеток.
   1. Инокулизируйте одну колонию B. coagulans в семенной среду и инкубуйте при 50 °C, 200 об/мин в течение 12 часов, пока культура не достигнет средней логарифмической фазы.
   2. Подготовьте последовательное разбавление бактериальной суспензии с градиентами 10,⁴, 10,⁵ и 10⁶.
   3. Пипетки по 100 мкл каждого разбавления равномерно распределяются на средней агаревой пластине в три экземпляра.
   4. Инкубировать все пластины агарных пластин при 50 °C в течение 24 часов.
   5. Считайте единицы формирования колоний (CFU) для каждого разбавления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка показывает, что OD₆₀₀ = 0,5 соответствует примерно 1 × 10⁸ CFU/mL. Используйте эту связь для определения начальной плотности клеток для инкапсуляции капель (дополнительный рисунок 3).
2. Культивируйте B. coagulans до средней и поздней логарифмической фазы, затем разведите свежую семянную культуру до_{OD 600} = 0,05 в свежей семенной среде.
3. Внутри ламинарного капюшона подготовьте восемь стерильных мелких металлических дисков и один большой металлический диск. Поджигайте восемь маленьких дисков на спиртовой горелке на 1 минуту, положите их на стерильный большой диск и дайте остыть 10 минут.
4. С помощью микропипетки равномерно распределите по 10 мкл разбавленной бактериальной суспензии на каждый из восьми охлаждённых малых дисков.
5. Переложите большой диск, несущий инокуленные малые диски, в стерильную чашку Петри.
6. Включите прибор ARTP и активируйте главный управляющий экран. Включите ультрафиолетовую лампу внутри камеры мутагенеза. Запустите охладитель и охладите его 20 минут, пока температура не стабилизируется на уровне 20 °C.
7. Быстро откройте дверцу камеры мутагенеза и положите внутрь маленькие диски.
8. Используя стерильные щипцы, последовательно переносите каждый маленький диск на стадию образца ARTP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность РЧ, расход газа гелия, расстояние от сопла до образца и чистота гелия были зафиксированы на уровне 120 Вт, 10 SLM, 2 мм и 99,999% соответственно. Время облучения гелием было установлено на 5, 10, 15, 20, 25 и 30 секунд соответственно.
9. Подвергайте каждый малый диск мутагенезу ARTP согласно установленным параметрам. После облучения переместите все диски в центрифугную трубку объемом 50 мл с 10 мл среды восстановления. Инкубировать при 50 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 4 часов для восстановления и роста клетки.
10. Определение уровня летальности.
    1. Последовательно разбавляйте восстановленную культуру до градиента от ^10-2 до ^10-6.
    2. Распределите по 100 мкл каждого разбавления на тарелки для среднего агара и подготовьте три реплики для каждого разбавления.
    3. Инкубировать все тарелки при 50 °C в течение 24 часов.
    4. Посчитайте колонии и рассчитайте соответствующий CFU/mL.
    5. Рассчитайте коэффициент летальности с помощью формулы:
       (1)
       ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите эксперимент в трёх экземплярах для каждой временной точки. Оптимальное время мутагенеза для ARTP в этом случае составляет 20 с (дополнительный рисунок 4).

3. Состав автоматизированной капельной микрофлюидной платформы и расходных материалов

1. Система привода (рисунок 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Он состоит из 3 каналов высокоточных контроллеров давления с диапазоном давления 0–1000 мбар и временем отклика давления < 50 мс (рисунок 1A).
2. Система визуализации
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высокоскоростная CMOS-микроскопическая съёмка обеспечивает высокоскоростное получение данных ≥ 2 ГБ/с, частоту кадров от 0 до 20 000 кадров в секунду и максимальное разрешение 1280 x 860. Система оснащена автофокусом для наблюдения за движением капель в реальном времени и поддерживает запись изображений и видео, которые можно экспортировать в различных форматах, включая BMP, AVI, MP4 и TIF.
3. Система обнаружения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Он обеспечивает обнаружение флуоресцентных сигналов с помощью 2 лазеров: 488 нм и 633 нм, а также 2 каналов обнаружения.
4. Система управления хостом
   ПРИМЕЧАНИЕ: Управляемая автоматизированным программным обеспечением для микрофлюидной платформы капель, система интегрирует несколько модулей, включая привод жидкости, микроскопическую визуализацию, возбуждение и обнаружение, генерацию капель, пико-инжекцию и сортировку. Также поддерживается сбор, запись, хранение, отображение и экспорт экспериментальных данных. Показаны частичные рабочие единицы автоматизированной капельной микрофлюидной платформы (рисунок 1B).
5. Расходные материалы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расходники, используемые в этом протоколе, включают: инжекторную трубку для фазы масла, образца и реагента (рисунок 2A); сборную трубку для инкубации капель (рисунок 2B); чип генерации капель (рисунок 2C); капельный пико-инжекционный чип (рисунок 2D); и чип сортировки капель (рисунок 2E).

4. Генерация капель

ВНИМАНИЕ: Очистите автоматическую платформу микрофлюида для капель. После каждого эксперимента протирайте ступень, держатель для чипов и все места проливания этанолом 75% с помощью салфеток без ворса. Удалите остаточное фторированное масло, элементарную суспензию или раствор датчиков.

1. Инкапсуляция одной ячейки. Чтобы получить λ = 0,1 в 14 каплях pL, бактериальную суспензию разведите до_{OD 600} ≈ 0,04 (_{OD 600}=0,5 соответствует 1 × 10⁸ CFU/mL). Согласно распределению Пуассона:
   (2)
   Когда λ = 0,1, 90,5% капель пусты, 9,1% содержат одну ячейку, а 0,4% содержат несколько ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае измеренная эффективность инкапсуляции одной ячейки составила 11,2% (дополнительный рисунок 5). Количество клеток в капле можно определить с помощью DAPI-окрашивания. Когда λ = 0,1 и скорость инкапсуляции нескольких клеток превышает 1%, OD₆₀₀ следует уменьшить, чтобы уменьшить долю капель с несколькими клетками.
2. Pipette 300 мкл фторированного масла в флакон для входа масляной фазы. Пипетта 500 мкл бактериальной суспензии в впускной флаконе водной фазы.
3. Снимите ленту, покрывающую поверхность чипа генерации капель. Подключите флакон с нефтью, пробу и флакон для сбора в соответствующие скважины чипа последовательно.
4. Поставьте чип на сцену и закрепите его. Подключайте воздушные трубки к входным флаконам по одной согласно маркировке газового пути.
5. Откройте автоматизированное программное обеспечение микрофлюидной платформы капель. Отрегулируйте ручку движения ступени в соответствии со стрелками на чипе, чтобы переместить поле зрения к месту генерации капель.
6. Нажмите «Старт» в интерфейсе «Генерация капель» автоматизированного программного обеспечения микрофлюидной платформы капель (рисунок 3A). В интерфейсе изображения перетащите ползунки «ось Z» и яркости источника света, чтобы отрегулировать чёткость и яркость.
7. Нажмите на кнопки «+» и «-» в «Droplet Speed» и «Droplet Size», чтобы отрегулировать скорость генерации и размер капель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае давление в масляной фазе и в пробной фазе для генерации капель автоматически устанавливаются на 300 мбар и 400 мбар соответственно, чтобы достичь скорости генерации 1500 Гц. При таких настройках объём капель составляет 14 пл, при этом CV диаметра капли поддерживается ниже 5%, что обеспечивает стабильный размер капель и надёжную работу на последующих этапах.
8. Подождите 1 минуту, пока оборудование стабилизируется и состояние генерации капель останется стабильным. Быстро замените флакон для сбора капель, чтобы начать сбор капель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее добавьте небольшое количество фторированного масла в новую трубку для сбора трубки, чтобы закрыть нижний отверстие тефлоновой трубки, чтобы капли не соприкоснулись напрямую со стенкой трубки и не вызвали сплавление.
9. Прекратите сбор капель через 30 минут работы. Нажмите «Стоп» в всплывающем окне, чтобы подтвердить прекращение генерации капель.
10. Аккуратно снимите сборную трубку из чипа. Поставьте трубку и флакон для сбора вертикально и дождитесь, пока капли из трубки попадут в ампулу.
11. Снимите чип, флакон для впуска масла и водный флакон со ступеня. Протрите поверхность сцены спиртом 75%. Затем завершается этап генерации капель.

5. Выращивание с помощью капель

1. Добавьте 1 мл минерального масла в сборную трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слой минерального масла покрывает суспензию капель, чтобы минимизировать испарение и уменьшить воздействие кислорода, при этом обеспечивая при этом достаточный газообмен для факультативного анаэрба B. coagulans.
2. Поместите сборную трубку вертикально в центрифугу на 15 мл с стерильной водой. Держите сборную трубку свободно закрытой и инкубуйте при 45 °C в течение 10 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации убедитесь, что CV диаметра капли составляет <10% и не наблюдается слияние капель. Отбрасывайте партии, если эти критерии не выполнены.

6. Капельная пико-инъекция

ВНИМАНИЕ: Высокое напряжение подаётся на электроды чипа через соединение прибора во время пико-инжекции. Электрическое поле может вызвать сильный электрический удар. Не трогайте электроды или поверхность чипа металлическими инструментами или голыми руками, пока высокое напряжение активно. Всегда отключайте высоковольтный выход перед тем, как работать с чипом. Носите утеплённые перчатки и используйте непроводящие инструменты.

1. Подготовьте флакон для входа масляной фазы. В ламинарной вытяжке пипетка введите 300 мкл фторированного масла в флакон фазы масла.
2. Подготовьте флакон для впуска образца. Снимите крышку флакона из трубки, в которой находятся капли. Замените его на новую крышку.
3. Обрежьте кончик нового флакона для впуска. Отрежьте небольшой участок от передней части нового флакона для впуска, чтобы кончик опускался ниже уровня жидкости капель в ампуле для образца.
4. Затяните крышку. Плотно закрепите крышку, чтобы предотвратить протечку.
5. Подготовьте флакон для впуска реагента. Пипетта 500 мкл датчика молочной кислоты в флакон реагента.
6. Добавьте PBS в флакон реагента. Одновременно добавьте 500 мкл стерильного PBS-буфера в тот же флакон реагента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте добавлен буфер PBS для балансировки pH каплей. Итоговая рабочая концентрация лактатного датчика составляла 0,1 мг/мл, а объём нагрузки лактатного датчика — 500 мкл.
7. Используйте лезвие, чтобы разрезать ленту, закрывающую ямы электродов, чтобы открыть электроды. Установите мультиметр в режим непрерывности и проверьте подключение цепи и статус короткого замыкания чипа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если мультиметр показывает нормальное соединение электродов чипа, переходите к следующему этапу. Если цепь разорвана, замените инжекторный чип и протестируйте снова.
8. После подтверждения нормального подключения с мультиметром откройте ленту с поверхности чипа. Подключите флакон с нефтью, пробо, реагент и флакон для сбора в соответствующие скважины чипа последовательно.
9. Поставьте чип на сцену и закрепите его. Подключайте воздушные трубки к входным флаконам по одной согласно маркировке газового пути.
10. Откройте автоматизированное программное обеспечение микрофлюидной платформы капель. Отрегулируйте ручку движения ступени в соответствии со стрелками на чипе, чтобы переместить поле зрения в область электрода капельного чипа.
11. Нажмите «Старт» в интерфейсе «Капельная Пико-инжекция» автоматизированного программного обеспечения микрофлюидной платформы капель (рисунок 3B). В интерфейсе изображения перетащите ползунки «ось Z» и яркости источника света, чтобы отрегулировать чёткость и яркость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент прибор автоматически регулирует давление насоса в масляной фазе до 400 мбар, давление насоса в пробной фазе до 420 мбар, а давление насоса в фазе инжектора реагента до 450 мбар.
12. На начальном этапе работы сегмент воздуха из катетера будет разряжен в чип, что является нормальным явлением и длится несколько минут.
13. Ждите, пока капли попадут в поле зрения. Нажмите «Начать инъекцию Пико». В этот момент активируется электрическое поле оборудования. Регулируйте скорость генерации капель, расстояние между капельями и объём впрыскивания, нажимая кнопки «+» и «-» в «Droplet Speed», «Droplet Spacing» и «Injection Volume».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрическое поле установлено на максимальную передачу по умолчанию. Если капли разрушаются в области электрического поля во время процесса термоядерного синтеза, переходите на среднюю или низкую передачу. В данном случае частота впрыска капель составляла 200 Гц.
14. Наблюдайте в программном обеспечении высокоскоростного отображения изображений. Если капли стабильно вводятся в датчик молочной кислоты в соотношении 1:1, подождите 5 минут, пока оборудование стабилизируется. Быстро замените флакон для сбора капель, чтобы начать сбор капель.
15. После стабильной инъекции в течение 2 часов нажмите «Стоп», чтобы завершить капельную пико-инъекцию.
16. Аккуратно снимите сборную трубку из чипа. Поставьте трубку и флакон для сбора вертикально и дождитесь, пока капли из трубки попадут в ампулу.

7. Сортировка капель

ВНИМАНИЕ: Демульгатор является раздражителем и может вызывать раздражение кожи и глаз. Он также вреден при вдыхании или проглатении. Всегда носите соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат, защитные очки). Держите демульгатор в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжной вытяжке. Собирайте демульгатор в отдельный контейнер с четкой маркировкой. Не льйте в раковину.

1. В ламинарном проточном капюшоне пипетка 300 мкл фторированного масла и добавьте его в флакон для входа масляной фазы. Замените впускную крышку флакона в трубке с микроинъекционными каплями на новую крышку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением экспериментов по сортировке капель возьмите 5 мкл капель и осмотрите их под флуоресцентным микроскопом. Измерьте диаметр не менее 200 капель; Продолжайте только если CV < 10%.
2. Используйте лезвие, чтобы разрезать ленту, закрывающую ямы электродов, чтобы открыть электроды. Установите мультиметр в режим непрерывности и проверьте подключение цепи и статус короткого замыкания чипа.
3. После подтверждения нормального подключения с мультиметром откройте ленту с поверхности чипа. Подключите флакон с маслом, пробу и сортировочный флакон к соответствующим скважинам чипа последовательно.
4. Поставьте чип на сцену и закрепите его. Подключайте воздушные трубки к входным флаконам по одной согласно маркировке газового пути.
5. Откройте высокоскоростное программное обеспечение для визуализации. Отрегулируйте ручку движения ступени в соответствии со стрелками на чипе, чтобы переместить поле зрения в область электрода капельного чипа.
6. Нажмите «Старт» в интерфейсе «Сортировка капель» автоматизированного программного обеспечения микрофлюидной платформы капель. В интерфейсе изображения перетащите ползунки «ось Z» и яркости источника света, чтобы отрегулировать чёткость и яркость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После нажатия «Старт» прибор автоматически регулирует давление масляного насоса до 300 мбар, а давление в пробном насосе — до 190 мбар, что приводит к пропускной способности капель 100 Гц.
7. На начальном этапе работы сегмент воздуха из катетера будет разряжен в чип, который длится несколько минут и является нормальным явлением.
8. Нажмите, чтобы выбрать «Laser» и канал обнаружения 488 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальный персонал может выбрать лазер диаметром 488 нм, лазер на 633 нм или их комбинацию, в зависимости от конструкции экспериментального обнаружения. Мощность лазера: 20 мВт.
9. Нажмите «Запись данных». Прибор начнёт принимать капельно-флуоресцентные сигналы (рисунок 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте флуоресцентные сигналы от 50 000 до 100 000 капель; Прибор автоматически сортирует значения сигнала и генерирует гистограмму флуоресцентного сигнала.
10. Исходя из сгенерированной гистограммы сигнала флуоресценции, установите порог сортировки на уровне верхних 0,1% от общего числа сигналов флуоресценции и собирайте капли с значениями сигнала флуоресценции выше этого порога.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае сортировочный элемент был настроен на сбор капель с флуоресцентной интенсивностью > 2750 (a.u.), что соответствует верхнему 0,1% капель.
11. Нажмите снова «Запись данных». Прибор перезаписывает флуоресцентные сигналы от оставшихся капель и сортирует целевые капли по порогу, установленному в разделе 7.10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся капельные сигналы также будут автоматически сортироваться и отображаться как флуоресцентная гистограмма.
12. После выбора целевой области капли включите «Переключатель сортировки» и установите значение «Сила отклонения». Оборудование начнёт сортировать капли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор обеспечивает три выбираемых уровня напряжения электрического поля (Высокий, Средний, Низкий). Для капель размером более 30 мкм выберите High; для капель меньше 25 мкм выберите Средний или Низкий. Это обеспечивает стабильное отклонение и оптимальную эффективность сортировки.
13. После стабилизации оборудования на 5 минут замените флакон для сбора положительных капель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время сортировки прибор непрерывно измеряет интенсивность флуоресценции каждой капли в реальном времени и сравнивает её с заранее установленным порогом. Только капли с флуоресцентной интенсивностью выше порога отклоняются и собираются в положительную трубку. Капля считается положительной, если прибор показывает флуоресцентный сигнал, превышающий порог сортировки, и одновременно наблюдается отклонение капли на интерфейсе визуализации, что подтверждает, что капля была успешно направлена в положительный канал сбора.
14. Прекратите сортировку капель после 4 часов стабильной работы. Нажмите «Стоп» в интерфейсе «Сортировка капель».
15. Аккуратно снимите сборную трубку из чипа. Поставьте трубку и флакон для сбора вертикально, чтобы капли из трубки попали в ампулу.
16. После завершения сбора капель нажмите на диаграмму рассеяния, чтобы сохранить диаграмму рассеяния эксперимента, значения флуоресцентных сигналов отсортированных положительных капель и значения флуоресцентных сигналов всех капель.
17. Извлеките чип, впускной флакон масляной фазы, пробный флакон и реагентный флакон со ступени. Закройте программу.
18. Капельная демульгация. Добавьте 500 мкл 1H, 1H, 2H, 2H-перфторооктанола в трубку для сбора капель. Подождите 5 минут, затем добавьте 500 мкл свежего скринингового материала для восстановления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не трясите сильно пробирку после добавления демульгификатора; Аккуратно перемешивайте. После капельной демульсификации между водной и масляной фазами образуется прозрачный интерфейс.
19. Возьмите 20 мкл демульгированной бактериальной суспензии, разведите её в 10 раз и распределите на две агарные пластины. Инкубировать при 50 °C в течение 2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разбавления можно корректировать в зависимости от количества собранных капель. В этом случае было получено около 400 отдельных колоний из двух плит.

8. Экспорт данных

1. Нажмите на график флуоресцентного сигнала в пустой области интерфейса сортировки программного обеспечения. Выберите сохранение графика рассеяния сигнала флуоресценции капель, гистограммы сигнала флуоресценции и таблицы Excel сигнала флуоресценции, которые содержат зафиксированные значения интенсивности флуоресценции общего числа капель, а также значения интенсивности флуоресценции скрининговых положительных капель.

9. Первичный скрининг микропластин

1. Выбирайте отдельные колонии случайным образом.
2. Инокуляция плиты глубокой скважины на 24 скважины для культуры расширения. Выберите каждую выбранную колонию и инокулируйте её в одну из пластин на 24 лунки, содержащую 2 мл ферментационной среды. Используйте прививочный контур.
3. Герметизируйте плиту глубокой скважины на 24 лунки недышащей мембраной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте дышащие мембраны. Это вызывает испарение культурной среды.
4. Развивайте культуру расширения. Поместите герметичную плиту глубокой скважины на 24 лунки в встряхивающий инкубатор при температуре 50 °C, 200 об/мин в течение 24 часов.
5. Субкультура для валидации ферментации. Через 24 часа перелите по 200 мкл культуры из каждой скважины в свежую плиту на 24 лунки, содержащую 1,8 мл ферментационной среды (10% в/в инокулума). Добавьте стерильный_{CaCO 3} до окончательной концентрации 4% (w/v) в каждую скважину перед инокуляцией, чтобы снизить pH.
6. Включите элементы управления. В каждой свежей глубокой пластине с 24 лунками заполните три случайно выбранные скважины с отрицательным контролем родительского штама ATCC 7050. Обрабатывайте их так же, как и штаммы кандидата.
7. Герметизируйте плиту глубокой скважины на 24 лунки недышащей мембраной.
8. Инкубировать плиту глубокой скважины на 24 лунки. Поместите запечатанную пластину в встряхивающий инкубатор при температуре 50 °C, 200 об/мин на 24 часа.
9. Подготовьте образцы для обнаружения лактата. Центрифугуйте пластину при 5 842 × г на 10 минут. Перенесите 10 мкл супернатанта на 96-луонную чёрную микропластину и разведите 990 мкл ультрачистой воды. Хорошо перемешивайте.
10. Добавьте датчик лактата. Добавьте 100 мкл разбавленной образца в каждую яме свежей 96-колодной чёрной пластины. Затем добавьте 100 мкл датчика молочной кислоты. Аккуратно перемешивайте.
11. Измерьте флуоресценцию. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 5 минут (защищённой от света). Измерять флуоресценцию с помощью считывателя микропластин с возбуждением на 485 нм и излучением на 515 нм.
12. Установите порог выбора попаданий. Вычислите среднюю флуоресценцию трёх родительских контрольных ямок (родительских) и стандартное отклонение (SD_parent). Определим порог как F_parent + 3 × SD_parent.
13. Определите основные попадания. Кандидат-штамм считается первичным ударом, если его флуоресцентный сигнал превышает порог. Запишите количество первичных результатов для дальнейшей валидации.

10. Вторичная валидация высокопродуктивных штаммов

ВНИМАНИЕ: В подвижной фазе содержится разбавлённая серная кислота (5 мМ), которая является коррозийной. Избегайте контакта кожи и вдыхания. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат, защитные очки). Подготовьте и обработайте подвижную фазу в хорошо проветриваемом помещении или вытяжной вытяжке. Соберите все кислотосодержащие отходы в специальный контейнер для правильной утилизации. Не льйте в раковину.

1. Подготовьте семянную культуру. Полоса основных ударов попадает на среднюю агаревую пластину. Инкубировать при 50 °C в течение 24 часов. Выберите по одной колонии с каждой тарелки и инокулируйте её в 30 мл жидкой среды для семян в 250 мл коктейльной фляжке. Инкубировать при 50 °C, 200 об/мин в течение 12 часов.
2. Организуйте ферментацию. Подготовьте ферментационную среду и добавьте стерильный CaCO3 порошок до конечной концентрации 4% (w/v) в качестве pH-нейтрализатора. Переложите 5 мл семенной культуры в 45 мл этой среды в колбу Эрленмайера объёмом 250 мл (10% инокуля V/V; окончательный рабочий объём 50 мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте три независимых колбы для каждого кандидатного штамма и для родительского штамма ATCC 7050 в качестве контроля.
3. Инкубировать фляжки. Поместите фляжки в встряхивающий инкубатор при температуре 50 °C, 200 об/мин. Ферментировать 24 часа.
4. Собирайте образцы. Через 24 часа возьмите по 1 мл культуры из каждой колбы. Центрифуга при 13 800 × г на 2 минуты. Разведите супернатант в 100 раз сверхчистой водой и профильтруйте через шприцовый фильтр толщиной 0,22 мкм.
5. Настройте условия для ВЭЖХ. Используйте колонку Aminex HPX-87H. Подготовьте подвижную фазу: 5 мМ H₂SO₄ в сверхчистой воде, фильтруйте через мембрану 0,22 мкм и дегазируйте с помощью соникации. Установите температуру колонки на 40 °C, расход 0,6 мл/мин, объём впрыска на 20 мкл и время работы на 20 минут на образцу (элюи молочной кислоты при ~12.600 мин). Используйте детектор преломления (RID).
6. Подготовьте стандартную кривую. Растворить L-лактат кальция в сверхчистой воде для получения стандартных растворов 0, 0,4, 0,8, 1,2 и 1,6 г/л (экспрессируется как кальций L-лактат). Вводите каждый стандарт в тройном экземпляре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постройте пиковую площадь по сравнению с концентрацией и получите уравнение линейной регрессии (^{R 2} > 0,999). Запускайте стандарты в начале и конце каждой партии образцов для коррекции дрейфа.
7. Вводите образцы. Ввести фильтрованные супернатанты ферментации (20 мкл) в систему ВЭЖХ. Запишите пиковую область для пика L-лактата кальция.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждые 10 образцов вводите образец для контроля качества (1 г/л кальция L-лактата) для мониторинга стабильности системы. Допустимый сдвиг времени хранения составляет <0,2 мин, а вариация пиковой площади <5% по сравнению с исходным стандартом калибровки.
8. Рассчитайте выход L-молочной кислоты. Интерполировать пиковую площадь каждого образца в стандартную кривую, чтобы получить концентрацию L-лактата кальция (g/L).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразуем концентрацию L-молочной кислоты с помощью соотношения молекулярной массы:
   (3)
   Вычислите процент улучшения:
   (4)
9. Определите финальные высокопродуктивные штаммы. Выберите штаммы, которые стабильно демонстрируют более высокий уровень L-молочной кислоты, чем родительский штамм, как валидированные мутанты. Выберите лучшего исполнителя для дальнейшей характеристики.

11. Оценка генетической стабильности высокопродуктивных штаммов

1. Разведите выбранный мутантный штамм на среднеобразные агарные пластины. Инкубировать при 50 °C в течение 24 часов. Это первое поколение.
2. Выберите одну колонию из пластины первого поколения и инокулируйте её в 5 мл жидкой семенной среды в трубке объемом 50 мл. Инкубировать при 50 °C, 200 об/мин в течение 12 часов, чтобы получить культуру F1.
3. Перенесите 10% (v/v) культуры семян первого поколения в 50 мл ферментационной среды (содержащей 4% w/v стерильного CaCO₃) в термофляже объемом 250 мл. Инкубировать при 50 °C, 200 об/мин в течение 24 часов.
4. После ферментации соберите 1 мл культуры. Центрифугу при 13 800 × г в течение 2 минут, разведите супернатант в 100 раз сверхчистой водой и измерите концентрацию L-молочной кислоты с помощью ВЭЖХ. Используйте три независимых колбы для каждого поколения.
5. Чтобы получить следующее поколение, нанесите петлю культуры первого поколения на свежую среднюю агарную тарелку. Инкубировать при 50 °C в течение 24 часов. Повторите шаги 11.2 и 11.3 для второго поколения.
6. Повторите процесс субкультурирования, чтобы получить третье и четвёртое поколения. Для каждого поколения подготовьте три термофляги и измеряйте образование молочной кислоты с помощью ВЭЖХ.
7. Сравните выходы четырёх поколений (1–4) с помощью одностороннего ANOVA или t-теста Студента. Штамм считается генетически устойчивым, если между поколениями не наблюдается значимой разницы (p > 0,05) в производстве молочной кислоты.

Результаты

На основе автоматизированной микрофлюидной платформы капель была создана модель высокопроизводительного скрининга. Мутантная библиотека B. coagulans была создана с помощью мутагенеза ARTP с оптимальным временем облучения 20 с, что дало летальность примерно 90% (рисунок 4A). Затем мутантные клетки были инкапсулированы в капли размером 14 пл диаметром примерно 30 мкм с частотой генерации 1500 Гц (см. рисунок 4B). После инкубации при 4...

Обсуждение

Этот протокол представляет собой стандартизированный рабочий процесс промышленного микробного скрининга на основе автоматизированной платформы капельной микрофлюидности. Интегрированный рабочий процесс включает создание мутантных библиотек, генерацию капель и инкапсуляцию одной клетки, культивирование микрореакторов, инъекцию биосенсоров, сортировку капель с флуоресценцией и окончательную валидацию целевых штаммов. Используя высокопроизводительный скрининг высокопродуктивного B. coag...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Для приготовления твердой пластинки
Безводное этиловое масло	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Для чистки и дезинфекции лабораторных столов и приборов
Атмосферная и комнатная температура плазмы (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  использовался для создания мутантной библиотеки для мутагенеза штамма.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 был использован в качестве исходного штамма для мутагенеза и целевой точки для высокопроизводительного капельного скрининга.
Черная микропластина (96 лунок)	Corning	3925	96-лунковая черная микропластина использовалась для анализов сенсоров лактата и определения концентрации молочной кислоты.
Углекислый кальций	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Для выделения гиперпродуцентов L-молочной кислоты.
Хлористый кальций	Sinopharm	10005819	Хлористый кальций используется для приготовления микробной питательной среды, обеспечивая необходимые питательные вещества для роста микроорганизмов.
L-лактат кальция	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Используется в качестве образцов для приготовления стандартной кривой в процессе обнаружения.
Центрифужная пробирка (15 мл)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Используется для разбавления бактериальной жидкости
Коллекционная пробирка	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Для сбора капель и последующего выращивания
Компьютер	Lenovo	E450	Установка программного обеспечения и управление DREM Cell.
DAPI	Solarbio	c0065	Для окрашивания клеток.
Глубокая лунка (24-лунковая)	BKMAMLAB	110424008	Для первоначальной проверки выхода мутантов B. coagulans с использованием глубокой лунки
Демулсатор (1H,1H,2H,2H-Перфтороктанол)	MACKLIN	H817022	Демулсатор капель используется для разрушения микрокапель воды в масле и высвобождения внутренних клеток, штаммов или супернатанта для последующего обнаружения и анализа.
D-глюкоза	Solarbio	G8150-1000	D-глюкоза используется для приготовления микробной питательной среды, обеспечивая необходимые питательные вещества для роста микроорганизмов.
Дицианистый водород аммония	Solarbio	D9950	Дицианистый водород аммония используется для приготовления микробной питательной среды, обеспечивая необходимые питательные вещества для роста микроорганизмов.
Безводное дигидрофосфат калия	Sigma-Aldrich	P8281	Безводное дигидрофосфат калия используется для приготовления микробной питательной среды, обеспечивая необходимые питательные вещества для роста микроорганизмов.
Версия программного обеспечения DREM	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Для управления прибором DREM Cell. Программное обеспечение DREM - это запатентованная коммерческая программа, исключительно для прибора DREM Cell от Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. У него нет публичного официального доступа или URL для загрузки, и он распространяется только с прибором по авторизации.
Микрофлюидный сортировщик клеток с заключением капель (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Он использовался для высокопроизводительного захвата и сортировки одиночных клеток для быстрого скрининга высокопродуктивных штаммов из мутантной библиотеки.
Чип для генерации капель	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	Чип для генерации капель используется для производства монодисперсных капель масштаба пиколитра (пЛ) для захвата одиночных клеток.
Чип для инъекции капель	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	Чип для микроинъекции капель используется для точной и следовой инъекции реагента в предварительно сформированные капли для последующих биохимических реакций.
Чип для сортировки капель	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	Чип для сортировки капель используется для сортировки целевых капель, содержащих высокопродуктивные клетки на основе флуоресцентных сигналов.
Колба Эрленмейера для колебательной культуры (250 мл)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Используется для верификации культуры масштабированного выращивания мутантов B. coagulans после первичного скрининга с использованием глубокой лунки, чтобы подтвердить стабильность и воспроизводимость высокопродуктивных штаммов.
Фильтровальные мембраны (0,22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Используется для фильтрации ферментационного бульона.
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Olympus	IX73	Флуоресцен