В этом исследовании было выявлено восемь потенциальных мишеней для лечения сердечной недостаточности с помощью генетического анализа и рассматривались кандидатные терапевтические соединения, связанные с этими выявленными мишенями.
Исследовательская статья
В этом исследовании было выявлено восемь потенциальных мишеней для лечения сердечной недостаточности с помощью генетического анализа и рассматривались кандидатные терапевтические соединения, связанные с этими выявленными мишенями.
Сердечная недостаточность (СН) — это распространённое сердечно-сосудистое заболевание, которое значительно ухудшает качество жизни на поздних стадиях. Несмотря на разнообразие современных стратегий лечения, нагрузка на заболевание HF остаётся значительной. Поэтому крайне необходимо исследовать новые терапевтические цели. В этом исследовании использовалась менделевская рандомизация (МР) для оценки причинно-следственных связей между генами, подлежащими лекарству, и HF. Для дальнейшей проверки связи между ними были проведены колокализация и сводная менделевская рандомизация (SMR) на основе данных. Наконец, было выявлено 8 потенциальных терапевтических мишеней для HF, включая 4 фактора риска (CYP11A1, GALT, KCNH2 и METRN) и 4 защитных фактора (APOM, CHD4, IL11RA и LPAR5). Анализ сетей обогащения GO, обогащения KEGG и взаимодействия белков и белка (PPI) показал, что эти гены в первую очередь участвуют в метаболической регуляции и электрофизиологических процессах сердца. Кроме того, были выявлены потенциальные препараты, направленные на эти мишени, с помощью прогнозирования препаратов и молекулярного докинга, включая митотан, Адель, бензофураны, 1,3-ди-о-толилгуанидин, 96-69-5 и броменоллактон. Кроме того, результаты ПЦР показали, что митотан может быть связан с CYP11A1 и KCNH2. Препараты, разработанные на основе этих потенциальных терапевтических целей, могут обеспечивать более высокую эффективность и улучшать клинические результаты.
Сердечная недостаточность (СН) — это распространённый сердечно-сосудистый синдром, характеризующийся нарушением полнения желудочков или сократимости миокарда, что приводит к недостаточному сердечному выбросу для удовлетворения метаболических потребностей 1,2,3. Клинически СН характеризуется легочной и системной заложенностью, гиперфузией тканей, а также симптомами, такими как одышка, усталость и периферический отёк 1,4,5. Несмотря на терапевтические достижения, HF остаётся ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире, затрагивая более 64 миллионов человек согласно исследованию Global Burden of Disease (GBD) 6,7,8. Значительная нагрузка на заболевания подчёркивает острую необходимость новых терапевтических стратегий.
Современные фармакологические и приборные вмешательства для ВЧ ограничены низкооптимальной эффективностью и побочными эффектами, что способствует устойчиво высокому уровню повторной госпитализации и ухудшению качестважизни 9,10,11,12. Поэтому выявление новых молекулярных мишеней с причинно-следственной связью с патогенезом HF имеет решающее значение для улучшения клинических результатов. Интеграция геномики в разработку лекарств представляет собой высокоэффективную стратегию повышения эффективности, поскольку генетически валидированные терапии демонстрируют значительно более высокий уровень успеха в клиническихиспытаниях 13,14,15. Кроме того, белки, кодируемые этими действенными генами, служат основными терапевтическими мишенями как для малых молекул, так и для моноклональныхантител 16,17.
Недавние достижения в человеческой генетике способствовали приоритизированию мишеней для лекарств посредством интегративного анализа общегеномных ассоциативных исследований (GWAS) и данных количественных признаков экспрессии (eQTL). Менделевская рандомизация (МР) использует генетические варианты как инструментальные переменные для оценки причинных эффектов, минимизируя смешивание и обратную причинность, присущиенаблюдательным исследованиям 13,14. В сочетании с колокализацией и суммарной МРТ (СМР) этот подход позволяет надёжно приоритизировать гены, модуляция которых может влиять на риск заболеваний, предлагая генетически закреплённую стратегию для обнаружениямишени 18,19,20. По сравнению с традиционными ассоциативными исследованиями, интеграция MR, SMR и колокализации помогает преодолеть смешение и обратную причинность, чтобы вывести надёжные причинно-следственные выводы. Кроме того, эта система фильтрует ложноположительные сигналы из дисбаланса связи, обеспечивая, что экспрессия генов и риск сердечной недостаточности совпадают с одним и тем же причинным вариантом, оптимизируя приоритетизацию целей. Стоит отметить, что хотя сердечно-сосудистые ткани обладают высокой специфичностью, это исследование в основном использует крупномасштабные данные крови cis-eQTL для максимизации статистической мощности. Хотя этот подход может не полностью отражать тканевые механизмы, присущие HF, варианты, полученные из крови, служат доступными биомаркерами и дают надёжное понимание системных генетических факторов заболевания.
В этом исследовании были использованы крупномасштабные наборы данных GWAS и eQTL для оценки причинного влияния лекарственных генов на риск HF. Значимые ассоциации были дополнительно подтверждены с помощью колокализации и анализа SMR. Для разъяснения биологических функций приоритетных мишень были проведены анализ обогащения Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Ges and Genomes (KEGG), а также анализ сетей взаимодействия белков и белков (PPI). Терапевтический потенциал впоследствии оценивался с помощью прогнозирования препаратов и молекулярного стыковки. Наконец, связи между выбранными генами, подлежащими лекарствуем, и кандидатами препаратами были подтверждены с помощью экспериментов in vitro .
В заключение, это исследование даёт важные выводы для открытия новых терапевтических мишеней для HF. Используя MR, SMR, колокализационный анализ, анализ обогащения генов, построение сети PPI, прогнозирование лекарств, молекулярное докингование и эксперименты in vitro , эти результаты могут способствовать разработке более эффективных терапевтических стратегий для HF.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все наборы данных, использованные в этом исследовании, были получены из ранее опубликованных исследований с этическим одобрением. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Дизайн исследования
Рабочий процесс этого исследования иллюстрируется на рисунке 1. Во-первых, данные о воздействии были получены из цис-eQTL генов, поддающихся лекарству. Во-вторых, был проведён МР-анализ для изучения причинно-следственной связи между генами, пригодными для лекарственного препарата, и HF. Кандидаты в терапевтические цели для HF были впоследствии выявлены с помощью колокализации и SMR-анализов. Затем были проведены анализ обогащения генов и построение сетей ИПП. Наконец, были проведены прогнозирование лекарств и молекулярное стыкование для изучения сродства препаратов с генами.
2. Источник данных
Всего было идентифицировано 6 888 генов, поддающихся лекарству из двух источников. Один набор данных включал 4 463 гена из ранее опубликованного исследования, объединившего несколько источниковданных 17. Другой набор данных содержал 5 012 генов из базы данных взаимодействия лекарств и генов (DGIdb)21. Подробная информация была иллюстрирована на сайте (https://www.dgidb.org/). После слияния и удаления дубликат для анализа осталось 6 888 уникальных лекарственных генов.
Данные Cis-eQTL были получены из консорциума eQTLGen (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html), который включает профили экспрессии из 31 684 образцов крови и охватывает 16 987генов 22.
Сводная статистика по HF была получена из выпуска R12 базыFinnGen 23, включающего 37 653 случая и 462 695 контрольных групп. Диагноз HF был основан на Международной классификации болезней (ICD), включая ICD-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, ICD-9—4029B|428 и ICD-8—42700|42710|428|7824. Все участники были европейского происхождения. Подробная информация доступна на сайте FinnGen и в оригинальной статье (https://www.finngen.fi/en/access_results).
3. Менделевский рандомизационный анализ
Инструментальные переменные (IV) были выбраны на основе трёх основных предположенийМР 24. Во-первых, капельницы напрямую связаны с факторами воздействия. Во-вторых, капельницы не связаны с факторами, вызывающими смешивание. Наконец, капельницы влияют на результат только через воздействие. Поскольку проксимальные eQTL обеспечивают более немедленный и надёжный регуляторный контроль над целевые гены, MR использовал исключительно SNP, расположенные в областях генов диаметром 100 кб, для максимизации биологической близости. Для отбора в SNP применялись строгие критерии. Все выбранные SNP находились в пределах 100 кб вперёд от стартового участка транскрипции и 100 кб ниже по течению от конечного участка транскрипции каждого лекарства гена. Включены только SNP с геномной значимостью (p < 5×10-8). Для минимизации дисбаланса связей (LD) LD выполнялось с использованием порога r2 0,001 и расстояния скопления 10 000 kb26. SNP с F-статистикой >10 сохранялись, вычисляемые по формуле: F = [R 2(N−k−1)]/[k(1−R 2)]27. Информация о SNP приведена в Дополнительной таблице 1.
Основными аналитическими методами были обратно-дисперсионно-взвешенные методы (IVW) и коэффициент Вальда. p-значение менее 0,05 считалось статистическизначимым 28,29. Коэффициент ложного обнаружения (FDR) применялся для корректировки p-значения с целью минимизации ложноположительныхрезультатов 30. Когда была доступна только одна SNP, использовался метод отношения Вальда; в противном случае применялась IVW. Анализы включали MR-Egger, взвешенную медиану, взвешенный режим и простой режим при наличии достаточного количества SNP.
Для проверки гетерогенности и плейотропии использовались Q-тест Кокрана и перехватный анализ MR-Egger. Значение Q-p, превышающее 0,05, указывало на отсутствие гетерогенности31. p-значение для перехвата MR-Эггера менее 0,05 указывало на наличие направленнойплейотропии 18. Наконец, был проведён тест с оставленным одним исключением, чтобы проверить, можно ли повлиять на результаты одной SNP. MR-анализ проводился с использованием пакета TwoSampleMR (версия 0.6.11) в R (версия 4.4.2).
4. Анализ колокализации
Анализ колокализации был проведён с использованием пакета coloc R (версия 6.0.1) для определения, влияют ли общие генетические варианты как на экспрессию генов, так и на рискHF 32. Предварительные вероятности того, что SNP будет связан с одним из признаков, и обе черты были установлены соответственно на 1 × 10-4 и 1 × 10-5. Апостериорные вероятности пяти гипотез можно вычислить: (1) PPH0: SNP не связаны с двумя признаками. (2) PPH1/PPH2: SNP ассоциируются с экспрессией генов или HF. (3) PPH3: SNP связаны с HF и экспрессией генов, но обусловлены разными SNP. (4) PPH4: SNP связаны с HF и экспрессией генов, и управляются распространёнными SNP. PPH4 > 0,8 считался доказательством колокализации.
5. Анализ SMR
Анализ SMR был проведён для изучения взаимосвязи между геном и HF с использованием программного обеспечения SMR (версия 1.3.1)33. Тест на гетерогенность в зависимых инструментах (HEIDI) был проведён для определения, связаны ли наблюдаемые ассоциации с связью. Значительное p-значение SMR (< 0,05) в сочетании с p-значением HEIDI > 0,05 интерпретировалось как доказательство истинной причинно-следственной связи, а не как связь, вызванная сценарием связи. Подробные операционные протоколы и вычислительные настройки доступны на официальном сайте.
6. Анализ обогащения
Анализ обогащения GO и KEGG был использован для характеристики биологических функций и путей скринингируемых потенциальных терапевтических целевыхгенов 34. Обогащение ГО включало биологические процессы (BP), молекулярные функции (MF) и клеточные компоненты (CC). Для проведения анализа обогащения35,36 использовались кластер пакета RProfiler (версия 4.14.6) и Pathview (версия 1.46.0).
7. Прогнозирование кандидата на препарат
Для выявления потенциальных терапевтических соединений анализ прогнозирования лекарств проводился с использованием базы данных Drug Signatures Database (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)37. В DSigDB включено 22 527 наборов генов, включая 17 389 уникальных соединений, охватывающих 19 531 ген. Были проанализированы связи между кандидатами генами и соединениями, а затем анализ обогащения для выявления потенциально релевантных препаратов, нацеленных на гены, связанные с HF.
8. Построение сетей взаимодействия белков
Сети взаимодействия белков и белков (PPI) были построены с помощью GeneMANIA (https://genem ania.org/)38. GeneMANIA может помочь формировать гипотезы о функции генов, анализировать списки генов и расставлять приоритеты генов для функционального тестирования.
9. Молекулярная стыковка
Молекулярное докингование проводилось для подтверждения пригодности лекарственных препаратов генов и их связи с кандидатами на препараты. Стыковочные симуляции помогают оценить аффинность связывания и паттерны взаимодействия между соединениями и целевые белки, тем самым обеспечивая приоритеты и оптимизацию кандидатов. Структуры белков были извлечены из Protein Data Bank (PDB) (http://www.rcsb.org/), а составные структуры — из PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)39. Стыковка осуществлялась с помощью CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php), который использует обнаружение полости для управления слепой стыковкой40,41. Подробную информацию о процедурах эксплуатации и настройках расчёта можно получить на официальном сайте.
10. Клеточная культура
Увековеченные человеческие кардиомиоцитные клетки (AC16) культивировались в специфической клеточной среде AC16 в стерильных условиях. Клетки поддерживались при 37 °C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO2. Культурная среда менялась каждые 2–3 дня, а клетки проходили примерно на 70%–80% слияния для поддержания оптимальных условий роста. Морфология и слияние клеток регулярно отслеживались с помощью световой микроскопии перед каждым экспериментом. Все процедуры культивирования клеток проводились в шкафу для биобезопасности для минимизации риска загрязнения. Для экспериментов с обработкой клетки AC16 посеивались в пластины с 6 лунками и давались прилипать на ночь перед введением обработки.
11. Количественная обратная транскрипция ПЦР (RT-PCR)
Клетки AC16 обрабатывались 200 мкм пальмитиновой кислоты (PA) или 20 мкм митотаном в течение 24 часов после достижения слияния примерно 60–70%. ПА растворялась в бычьей сыворотке альбумина (BSA), тогда как митотан растворялся в диметилсульфоксиде (DMSO). Все потенциально опасные реагенты обрабатывались в соответствии со стандартными лабораторными процедурами безопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты, включая перчатки и лабораторные халаты.
После обработки общая РНК была извлечена с помощью набора для экстракции РНК согласно инструкции производителя в условиях без РНКаз. Процедуры экстракции РНК проводились на льду, когда это было возможно, чтобы минимизировать деградацию РНК. Концентрация и чистота РНК оценивались перед последующим экспериментом, и для последующих анализов использовались только образцы с соотношением A260/A280 от 1,8 до 2,0.
Комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована с помощью комплекта обратной транскрипции согласно протоколу производителя. Впоследствии количественное RT-PCR было проведено с использованием SYBR Green Master Mix на системе обнаружения ПЦР в реальном времени. Каждая реакция была подготовлена в итоговом объёме 10 мкл, содержащем 5 мкл SYBR Green Master Mix, 0,4 мкл прямого праймера, 0,4 мкл обратного праймера, 1 мкл кДНК-шаблона и 3,2 мкл воды без нуклеазы. Усиление проводилось при следующих циклических условиях: начальная денатурация при 95 °C в течение 30 секунд, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 5 секунд и отжиг/расширение при 60 °C в течение 30 секунд. Каждый эксперимент проводился с тремя биологическими репликатами, и все реакции проводились в трёх экземплярах.
GAPDH использовался в качестве внутреннего референсного гена, а относительные уровни экспрессии мРНК CYP11A1 и KCNH2 рассчитывались с помощью метода 2−ΔΔCt . Один пик в анализе кривой расплава считался показателем специфического усиления. Последовательности праймеров, используемые для RT-PCR, приведены в дополнительной таблице 2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Менделевская рандомизация
Результаты МРТ, оценивающие причинные эффекты между экспрессией генов, подлежащих лекарствующим препаратам, и HF были представлены в дополнительной таблице 3. Статистически значимым считалось значение P, скорректированное по FDR, менее 0,05. Всего было выявлено 11 генов с значимыми причинными связями с HF (рисунок 2). Среди них шесть генов были связаны с повышенным риском HF, включая CDKN1A <...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом исследовании систематически оценивались причинно-следственные эффекты лекарственных генов на риск HF с помощью МРТ, выявив восемь потенциальных терапевтических целей. К ним относились четыре защитных фактора (APOM, CHD4, IL11RA и LPAR5) и четыре фактора риска (CYP11A1, GALT, KCNH2 и METRN). Эти ассоциации были дополнительно поддержаны анализом колокализации и SMR. Функциональная аннотация с помощью анализов GO, обогащения KEGG и сетей PPI показала, что эти гены могут влиять на HF ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Участники и исследователи исследования FinnGen признаются. Консорциум eQTLGen, DGIdb и другие исследователи, предоставившие публично доступные данные для этого анализа, также заслуживают благодарности. Эта работа была поддержана проектом Master's Research Innovation Первого клинического колледжа Чунцинского медицинского университета (CYYY-SSCX202516) и стандартизированной программой по диагностике и лечению сердечной недостаточности (2025cyjstg006).
Вклад автора
Хуилин Чжу участвовал в концептуализации, привлечении финансирования, исследовании, методологии, ресурсах, программном обеспечении, надзоре, валидации, написании оригинального черновика, а также рецензировании и редактировании рукописи. Сусинь Ло внесла вклад в финансирование, методологию, надзор, а также рецензирование и редактирование рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix | Abclonal | RK21203 | |
| AC16 | HyCyte | TCH-C119 | |
| Среда культивирования клеток AC16 | HyCyte | TCH-G119 | |
| Комплект для обратной транскрипции cDNA | Abclonal | RK20400 | |
| Система реального времени CFX96™ | Bio-Rad Laboratories | ||
| Митотан | TargetMol | T1199 | |
| Пальмитиновая кислота | TargetMol | T2908 | |
| Комплект для извлечения РНК | Abclonal | RK30120 |
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение