Методическая статья

Создание устройства «орган-на-чипе» с вертикально расположенным дентинно-пульпным комплексом с использованием человеческого диска дентина

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе описывается процесс изготовления и сборки устройства «орган-на-чипе» с вертикально расположенным комплексом «дентин–пульпа», включающего диск человеческого дентина и микроканалы, созданные методом фотолитографии, с последующим посевом и культивированием стволовых клеток пульпы зуба.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные доклинические модели, используемые в стоматологических исследованиях, включая модели на животных и статические клеточные культуры, имеют существенные ограничения в воспроизведении физиологических условий интерфейса «дентин–пульпа» и прогнозировании биологических реакций организма человека на стоматологические биоматериалы. Технология «орган-на-чипе» (OoC) предлагает альтернативный подход, позволяя воссоздавать тканеспецифичные микроокружения внутри контролируемых микрофлюидных систем. В данной работе представлен пошаговый протокол изготовления и сборки устройства OoC комплекса «дентин–пульпа», включающего диск человеческого дентина внутри трехслойной микрофлюидной платформы из полидиметилсилоксана (PDMS). Протокол включает подготовку диска дентина, изготовление микроструктурированных форм с помощью фотолитографии, литье и отверждение PDMS, связывание слоев с помощью плазменной обработки, сборку устройства, проверку на герметичность и посев стволовых клеток пульпы зуба в условиях статического культивирования. Обсуждаются критические параметры изготовления, влияющие на работу устройства, включая контроль толщины слоя PDMS, плазменную обработку поверхности и интеграцию диска дентина в устройство для минимизации утечек. Адгезия и жизнеспособность клеток внутри устройства оценивались с помощью сканирующей электронной микроскопии и конфокального окрашивания живых/мертвых клеток. Репрезентативные результаты демонстрируют успешную интеграцию диска дентина в микрофлюидную сборку, поддержание герметичности и адгезию жизнеспособных стволовых клеток пульпы зуба к поверхности дентина. Данный протокол предлагает воспроизводимый метод создания платформы OoC комплекса «дентин–пульпа», которая может быть использована в будущих исследованиях клеточных ответов на стоматологические биоматериалы и микроокружающие стимулы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных долгое время служили важным инструментом для углубления понимания патологических и физиологических процессов и играли центральную роль на ранних этапах разработки лекарственных средств1. В течение XX века ожидаемая продолжительность жизни людей существенно увеличилась, и хотя невозможно точно количественно оценить, в какой степени это улучшение обусловлено исключительно исследованиями на животных, общепризнано, что многие современные методы лечения были разработаны или подтверждены с использованием животных моделей2. Заметными примерами являются разработка вакцин против полиомиелита, кори и гепатита B, оценка безопасности и эффективности пенициллина, а также производство инсулина. В области исследований стоматологических и биоматериалов эти модели имели решающее значение для изучения процесса развития кариеса, биологии и регенерации дентинно-пульпарного комплекса, а также физиопатологии тканей периодонта3,4.

Несмотря на широкое применение этих методологий, текущий процесс разработки лекарственных средств по-прежнему характеризуется высоким уровнем неудач: многие препараты-кандидаты терпят поражение на этапе клинических испытаний, несмотря на подтвержденную эффективность и безопасность в условиях доклинических лабораторных исследований и на моделях животных5. Это несоответствие связывают с межвидовыми различиями, которые могут ограничивать трансляционную предсказательную способность моделей животных из-за анатомических, генетических и физиологических различий между видами6. Кроме того, разработка новых терапевтических подходов остается трудоемким и дорогостоящим процессом7. Более того, традиционные модели in vitro преимущественно используют упрощенные двухмерные (2D) монослойные культуры на нефизиологических пластиковых подложках, которые не воспроизводят биохимические и физические сигналы, межклеточные взаимодействия и сигнализацию внеклеточного матрикса (ECM), присутствующие в полости рта человека8,9. Хотя 2D-модели обладают определенными экспериментальными преимуществами, они по своей природе не способны воспроизвести сложные взаимодействия, происходящие между несколькими компонентами одновременно, такими как биопленки, биоматериалы, дентин и клетки пульпы10. Следовательно, растет интерес к разработке альтернативных экспериментальных платформ, способных более точно воспроизводить биологические реакции человека. В 2022 году Закон о модернизации FDA 2.0 отменил обязательное требование о тестировании на животных в процессе одобрения лекарств и признал возможность использования альтернативных платформ, включая технологии «орган-на-чипе» (OoC), в доклинических исследованиях11.

Орган-на-чипе (OoC) представляет собой микрофлюидное устройство, разработанное для воспроизведения структуры, функции и микроокружения конкретного органа или компонента ткани12. Эти устройства заселяют живыми клетками и тканями, культивируемыми в сконструированных микроканалах, которые воссоздают ключевые аспекты физиологической микросреды, в которой клетки находятся в естественных условиях. Помимо структурного подражания, микроканалы обеспечивают пространственно-временной контроль клеточного окружения и поддерживают сохранение тканеспецифических функций, создавая тем самым экспериментальные условия, которые могут более точно соответствовать физиологии in vivo, чем традиционные системы культивирования12. Особое значение имеет то, что микроканалы в устройствах OoC обеспечивают контролируемый поток культуральной среды, который оказывает напряжение сдвига на резидентные клетки13. Эти механические стимулы влияют на клеточные реакции, включая адгезию, пролиферацию, миграцию, экспрессию генов и межклеточные взаимодействия14,15. Кроме того, непрерывный поток среды способствует поддержанию микроокружения за счет подачи питательных веществ и удаления продуктов метаболизма16. Более того, сообщается, что некоторые платформы OoC по сравнению с традиционными 2D-культурами позволяют улучшить контроль показателей, связанных с окислительным стрессом, включая внутриклеточные активные формы кислорода и жизнеспособность клеток, в трехмерных (3D) моделях на чипе17. Таким образом, системы OoC стали перспективными платформами для изучения физиологии тканей, взаимодействий с биоматериалами и патологических процессов в контролируемых экспериментальных условиях18. В стоматологических исследованиях технология OoC постепенно применяется для моделирования все более сложных интерфейсов тканей полости рта19. Ранние платформы «зуб-на-чипе» имитировали интерфейс «биоматериал–дентин–пульпа»20, в то время как более совершенные итерации с тех пор включают сосудистую сеть и тройничное иннервационное обеспечение для более точного воспроизведения структурной и функциональной сложности пульпо-дентинного комплекса21. Помимо пульпы, 3D-модели недоразвитых корневых каналов позволили оценить действие эндодонтических ирригантов и ангиогенное прорастание стволовых клеток из апикальной папиллы22,23. На уровне периодонта платформы «десна-на-чипе» использовались для исследования взаимодействий между хозяином и микробами, а также для оценки иммуномодулирующего потенциала пробиотиков в качестве терапевтических средств24, в то время как устройства «периодонтальная связка-на-чипе» продемонстрировали, как поток интерстициальной жидкости модулирует формирование сосудистой сети и остеогенную дифференцировку сфероидов стволовых клеток периодонтальной связки25,26. В дополнение к этим моделям специализированные системы «слизистая оболочка полости рта-на-чипе» и «зубной имплантат-на-чипе» еще больше расширили сферу микрофлюидных стоматологических исследований, позволив охарактеризовать взаимодействия «хозяин–материал» и цитотоксичность стоматологических мономеров в физиологически значимых условиях27,28.

Несмотря на то, что системы «орган-на-чипе» (OoC) все чаще применяются в стоматологических, оральных и краниофациальных исследованиях, дальнейшие усилия по стандартизации и обеспечению воспроизводимости рабочих процессов изготовления остаются важными. В литературе описано несколько моделей «зуб-на-чипе»20,29,30,31, демонстрирующих различные конфигурации устройств и варианты их экспериментального применения. Однако различия в архитектуре устройств, методах изготовления, способах включения дентина и описании экспериментальных параметров могут ограничивать воспроизводимость и возможность прямого сравнения исследований. В частности, различия в геометрии микроканалов, стратегиях интеграции дентина и подходах к изготовлению могут влиять на биологическую и механическую микросреду внутри устройства. В некоторых описанных моделях используется дентин для воспроизведения аспектов интерфейса «дентин–пульпа»20,29,30, тогда как в других применяются альтернативные конфигурации31. Кроме того, методы изготовления, такие как фотолитография, лазерная резка, микрофрезерование и 3D-печать, имеют свои специфические преимущества и ограничения в зависимости от предполагаемого дизайна и применения устройства. Более того, критическим определяющим фактором биологической применимости является архитектурная ориентация устройства, а именно — расположены ли каналы и срез дентина в горизонтальной или вертикальной конфигурации19,32. В горизонтально-стековых конфигурациях отсеки, расположенные бок о бок, облегчают латеральную компартментализацию и визуализацию клеток в режиме реального времени, что делает их особенно подходящими для моделирования тканей с изначально латеральной пространственной организацией, таких как периодонтальный комплекс24,32. Однако этот дизайн по определению ограничен в способности воссоздавать перпендикулярные биологические интерфейсы, такие как комплекс «биоматериал–дентин–пульпа», поскольку латеральное расположение отсеков неточно воспроизводит ориентацию дентинного барьера in vivo между полостью и пульпой20,32. Вертикально-стековые конфигурации устраняют эти ограничения путем наложения двух отсеков вдоль оси y, разделенных нативным срезом дентина, что позволяет одновременно количественно оценивать молекулярный транспорт через неповрежденный дентин и в режиме реального времени контролировать реакции клеток пульпы, измеряемые в выходящей среде30. Тем не менее, признанным ограничением такой ориентации является получение поперечных изображений интерфейса «дентин–клетка», так как получение таких изображений в одной фокальной плоскости остается технически более сложной задачей, чем в горизонтально-стековых конфигурациях, где клетки и внеклеточный матрикс расположены латерально. Хотя в литературе описано множество моделей комплекса «дентин–пульпа» на чипе, большинство из них используют горизонтально-стековую конфигурацию, в которой отсеки расположены бок о бок в одной плоскости10,20,21,29, в то время как относительно немногие из них включали нативный срез дентина в вертикально-стековую конфигурацию30. Тем не менее, различия в подходах к изготовлению и параметрах описания в этих моделях по-прежнему ограничивают воспроизводимость и возможность межисследовательских сравнений33. Целью данной рукописи является повышение методологической воспроизводимости путем предоставления подробного протокола изготовления вертикально-стекового устройства «зуб-на-чипе», что будет способствовать более широкому внедрению данной платформы в стоматологическом исследовательском сообществе.

В данной работе представлен пошаговый протокол изготовления и сборки устройства «орган-на-чипе» (OoC) с вертикально ориентированным комплексом «дентин–пульпа», включающим диск человеческого дентина внутри трехслойной микрофлюидной платформы из полидиметилсилоксана (PDMS), изготовленной с использованием формы, полученной методом фотолитографии. Протокол также описывает посев и культивирование стволовых клеток пульпы зуба внутри устройства в статических условиях.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено Комитетом по этике Universidad de La Frontera для исследований с использованием образцов человеческого происхождения.

1. Получение диска дентина

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте конструкцию устройства перед началом выполнения протокола (Рисунок 1A–1C).

  1. Сбор и хранение зубов
    1. Соберите здоровые человеческие моляры или премоляры после получения информированного согласия пациента.
    2. Храните все образцы в 0,5% растворе хлорамина при 4°C для предотвращения дегидратации дентина и денатурации белков.
    3. Заменяйте раствор хлорамина один раз в неделю в процессе хранения.
  2. Приготовление дисков из дентина
    1. Разрежьте каждый зуб горизонтально по средней трети коронки, используя высокоскоростной наконечник с частотой вращения 350,000 rpm, оснащенный цилиндрическим алмазным бором (диаметр 1 mm; размер зерна 100–150 µm).
    2. Выполняйте распиловку при непрерывном водяном охлаждении со скоростью потока примерно 50 mL/min.
    3. Расположите срез на уровне средней трети коронки, чтобы избежать попадания в пульповую камеру и затрагивания эмали в области окклюзионных борозд и фиссур, тем самым получая диск, состоящий преимущественно из ткани дентина.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Выполняйте распиловку зубов при непрерывном охлаждении и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, маску и защитные очки.
  3. Финишная обработка дисков из дентина
    1. Отполируйте диск из дентина, используя последовательно диски для финишной обработки с уменьшающимся размером зерна.
    2. Продолжайте полировку до достижения окончательной толщины дентина примерно 0.8 mm (±± 0.3 mm) и поперечных размеров примерно 5 mm × 5 mm (±± 0.3 mm) (Рисунок 1D).
  4. Хранение дисков из дентина
    1. Храните подготовленные диски из дентина в 0,5% растворе хлорамина при 4°C до сборки устройства OoC.

Сборка и тестирование микрофлюидного устройства, диаграмма с размерами компонентов, изготовление, гидродинамика.
Рисунок 1: Процесс проектирования и изготовления устройства «орган-на-чипе» (OoC) дентинно-пульпарного комплекса. (A) Трехмерный дизайн устройства, демонстрирующий трехслойную архитектуру. (B) Вид сверху на дизайн устройства с указанием основных размеров. (C) Вид сбоку на конфигурацию трехслойного устройства. (D) Репрезентативный дентинный диск, приготовленный с приблизительной толщиной 0.8 mm и латеральными размерами примерно 5 mm × 5 mm. (E) Кремниевая мастер-форма, изготовленная методом фотолитографии и используемая для отливки верхнего и нижнего слоев полидиметилсилоксана (PDMS). (F) Снятие отвержденного слоя PDMS с кремниевой формы после термической полимеризации. (G) Плазменная обработка поверхности PDMS перед склеиванием слоев. (H) Готовое трехслойное устройство OoC дентинно-пульпарного комплекса, собранное методом плазменного склеивания и включающее дентинный интерфейс. (I) Собранное устройство, подключенное к трубкам для проверки на герметичность и подготовки к микрофлюидным экспериментам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Изготовление устройства «дентин-пульпа комплекс на чипе»

  1. Подготовка рабочего пространства и материалов
    1. Подготовка материалов и оборудования
      1. Подготовьте все материалы и оборудование, перечисленные в таблице материалов, перед началом изготовления устройства.
      2. Подготовьте биопсийные панчи перед сборкой устройства.
      3. Выполняйте все процедуры изготовления в чистой, безпыльной среде.
      4. В течение всего процесса изготовления и сборки устройства используйте перчатки, защитные очки и соответствующие средства индивидуальной защиты.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте форму, изготовленную методом фотолитографии, перед началом протокола (Рисунок 1E).
  2. Изготовление микроструктурированной формы
    1. Подготовка кремниевой пластины
      1. Изготовьте форму на 4-дюймовой кремниевой пластине с односторонней полировкой (N-тип, легированная As, метод выращивания CZ, ориентация <100>, толщина 500 ± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, удельное сопротивление 0.001–0.005 Ω·cm).
      2. Последовательно очистите пластину в ацетоне, изопропаноле и ультрачистой воде по 10 мин в каждом с использованием ультразвуковой очистки.
      3. Высушите пластину сжатым воздухом.
      4. Прокалите пластину на нагревательном столе при 200°C в течение 10 мин для удаления остаточной влаги.
      5. Дайте пластине остыть до комнатной температуры (RT; 20°C–25°C).
    2. Активация поверхности и нанесение фоторезиста
      1. Активируйте поверхность кремниевой пластины с помощью вакуумного плазменного очистителя, используя воздушную плазму на уровне 7 в течение 120 с.
      2. Нанесите негативный фоторезист на эпоксидной основе GM 1060 методом центрифугирования при 300 об/мин в течение 10 с.
      3. Продолжите центрифугирование при 565 об/мин в течение 100 с и при 965 об/мин в течение 1 с с ускорением 200 об/мин/с.
      4. Дайте покрытой пластине отстояться в течение 10 мин.
      5. Проведите предварительный обжиг при 65°C в течение 10 мин.
      6. Продолжите предварительный обжиг при 95°C в течение 1 ч.
      7. Дайте пластине остыть до RT.
    3. Экспонирование и проявление
      1. Экспонируйте фоторезист с помощью системы прямой лазерной литографии при дозе 1,950 mJ/cm2.
      2. Проведите послеэкспозиционный обжиг при 65°C в течение 10 мин.
      3. Продолжите послеэкспозиционный обжиг при 95°C в течение 30 мин.
      4. Дайте пластине остыть до RT.
      5. Дайте пластине отстояться в течение 10 мин.
      6. Проявите рисунок в PGMEA в течение 4 мин.
      7. Продлите проявление интервалами по 30 с, если остался незасвеченный фоторезист.
      8. Остановите проявление, промыв изопропанолом.
      9. Высушите пластину сжатым воздухом.
    4. Финальный обжиг
      1. Проведите финальный обжиг при 135°C в течение 2 ч.
      2. Получите микроструктурированную мастер-форму, содержащую микроканалы шириной 1 mm и высотой 50 µm.
  3. Приготовление и дегазация смеси PDMS
    1. Приготовление смеси PDMS
      1. Смешайте основу PDMS и отвердитель в весовой пропорции 10:1.
      2. Перемешивайте смесь вручную стеклянной палочкой в пластиковом стакане примерно 5 мин.
      3. Во время перемешивания совершайте медленные и непрерывные круговые движения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания пузырьков воздуха при перемешивании.
    2. Дегазация
      1. Поместите смесь PDMS в вакуумный эксикатор, подключенный к вакуумному насосу.
      2. Дегазируйте смесь при давлении примерно 700 mmHg в течение 5 мин.
      3. Кратковременно сбросьте вакуум, чтобы дать лопнуть поверхностным пузырькам.
      4. Снова создайте вакуум.
      5. Повторяйте цикл до тех пор, пока не исчезнут все видимые пузырьки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время дегазации обычно составляет примерно 30 мин.
  4. Отливка PDMS в форму
    1. Подготовка формы
      1. Поместите форму на плоскую поверхность.
      2. Очистите форму сжатым воздухом.
      3. Избегайте прямого контакта с текстурированной поверхностью.
      4. Убедитесь, что форма очищена от пыли и загрязнений.
    2. Дозирование PDMS
      1. Дозируйте примерно 8 g PDMS вокруг дентинного диска для изготовления слоя внедрения дентина.
      2. Отрегулируйте высоту PDMS в соответствии с толщиной дентинного диска (0.8 ± 0.3 mm).
      3. Следите за тем, чтобы PDMS не покрывал поверхность дентина.
      4. Дозируйте примерно 0.26 g PDMS на единицу формы для изготовления каждого слоя микроканалов.
      5. Осторожно постучите по форме или примените вибрацию, чтобы облегчить заполнение микроструктур.
      6. Дайте PDMS распределиться по самым мелким элементам.
      7. Накройте форму крышкой или плоским покрытием, не касаясь поверхности PDMS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Слой внедрения дентина имеет толщину примерно 0.8 mm, а каждый слой микроканалов — примерно 0.4 mm, что дает общую толщину устройства примерно 1.6 mm.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте толщину слоя в соответствии с рабочим расстоянием конфокального объектива, если планируется конфокальная визуализация.
  5. Отверждение
    1. Поместите формы в печь при 50°C.
    2. Отверждайте PDMS в течение 4 ч.
  6. Извлечение слоев PDMS
    1. Извлечение отвержденного PDMS
      1. Осторожно отделите отвержденные слои PDMS от формы (Рисунок 1F).
      2. Осторожно обращайтесь со слоями PDMS, чтобы не повредить микроструктуры.
  7. Склеивание слоев PDMS и изготовление входных и выходных портов
    1. Изготовление входных и выходных портов
      1. Сделайте перфорации в предназначенных местах входа и выхода с помощью биопсийного панча диаметром 1 mm.
      2. При прокалывании расположите сторону с микроканалами вверх.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите слой PDMS на режущий мат, чтобы избежать структурных повреждений.
      3. Сделайте два отверстия в верхнем слое, соответствующих верхнему микроканалу.
    2. Очистка слоев PDMS
      1. Очистите слои PDMS с помощью изопропилового спирта или этанола.
      2. Удалите остаточные частицы пыли с помощью стерильной клейкой ленты.
      3. Перед сборкой убедитесь, что все поверхности склеивания очищены от загрязнений.
    3. Плазменная активация поверхностей PDMS
      1. Расположите верхний и средний слои PDMS для плазменной обработки (Рисунок 1G).
      2. Активируйте поверхности с помощью ручного коронного плазменного активатора, работающего при мощности примерно 25 W с использованием окружающего воздуха в качестве рабочего газа.
      3. Соблюдайте рабочее расстояние примерно 1 mm между источником плазмы и поверхностью PDMS.
        ОСТОРОЖНО: Проводите плазменную обработку при соответствующей вентиляции и избегайте прямого воздействия озона, генерируемого плазмой.
      4. Включите устройство плазменной обработки и дайте ему стабилизироваться в течение 5 с.
      5. Перед обработкой убедитесь в формировании равномерного плазменного луча.
      6. Обрабатывайте верхний слой PDMS в течение 10 с, совершая непрерывные возвратно-поступательные движения со скоростью примерно 5 mm/s.
      7. Обрабатывайте средний слой PDMS в течение 10 с, используя те же движения и расстояние.
      8. Примените дополнительную плазменную обработку верхнего слоя в течение 1 с непосредственно перед склеиванием.
    4. Склеивание верхнего и среднего слоев
      1. Сразу после плазменной обработки совместите верхний микроканал с дентинным диском.
      2. Склейте верхний и средний слои.
      3. Поместите склеенную сборку в печь при 75°C на 5 мин.
      4. Укрепите соединение во время инкубации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Дентинный диск и микроканал видны невооруженным глазом, поэтому их можно совместить без дополнительных инструментов выравнивания.
    5. Изготовление портов нижнего микроканала
      1. Проколите два отверстия, соответствующих нижнему микроканалу, через склеенные верхний и средний слои.
      2. Выполняйте прокалывание через оба слоя одновременно для обеспечения совмещения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура создает четыре отверстия в верхнем слое и два отверстия в среднем слое.
      3. Перед прокалыванием поместите склеенную сборку на плотный режущий мат.
      4. Приложите устойчивое давление вниз одним движением.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вращательных или боковых усилий, чтобы минимизировать риск расслоения.
      5. Удалите остатки материала из мест перфорации с помощью безворсовой стерильной марли, смоченной изопропиловым спиртом.
      6. Осмотрите отверстия и окружающие склеенные области при достаточном освещении.
      7. Перед продолжением убедитесь в отсутствии расслоений, разрывов или незавершенных перфораций.
    6. Склеивание нижнего слоя
      1. Проведите плазменную обработку нижнего слоя, как описано в шаге 2.7.4.
      2. Совместите входные и выходные порты нижнего микроканала с отверстиями в верхнем и среднем слоях.
      3. Приклейте нижний слой, чтобы завершить сборку устройства.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения совмещения отметьте места входа и выхода на внешней поверхности нижнего слоя перед склеиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Плазменные камеры могут обеспечивать более прочное соединение, чем плазменные ручки, как сообщается в литературе36.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Готовое устройство представляет собой трехслойную микрофлюидную платформу, включающую дентинный интерфейс (Рисунок 1H). Нижняя поверхность дентина представляет собой сторону пульпы модели, тогда как верхняя поверхность дентина представляет собой корональную сторону для воздействия стоматологических биоматериалов или бактериальных препаратов.
  8. Тестирование микрофлюидного устройства на герметичность
    1. Осмотр собранного устройства
      1. Осмотрите собранное устройство на предмет смещения слоев.
      2. Осмотрите сборку на наличие неполного склеивания и видимых утечек.
    2. Тестирование на герметичность
      1. Подсоедините иглы Luer-lock 19G к входным портам (Рисунок 1E).
      2. Подключите иглы к трубкам микрофлюидного насоса.
      3. Осторожно прижмите основание иглы к проколотым портам для достижения герметичного соединения.
      4. Впрысните стерильный PBS или культуральную среду со скоростью потока 10 µL/min.
      5. Поддерживайте поток жидкости в течение как минимум 5 мин.
      6. Во время потока осматривайте все склеенные интерфейсы, края каналов и границы дентинного диска.
      7. Наблюдайте за устройством при достаточном освещении во время и после инъекции.
      8. Убедитесь в отсутствии скопления жидкости, влажности или образования капель.
      9. Классифицируйте устройство как герметичное, если утечек не обнаружено.
      10. Утилизируйте устройства, имеющие утечки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите тест на герметичность каждого изготовленного устройства перед посевом клеток или экспериментальным использованием.
  9. Стерилизация и хранение микрофлюидного устройства
    1. Стерилизация
      1. Воздействуйте на верхнюю поверхность собранного устройства УФ-светом (254 nm) в течение 30 мин в ламинарном шкафу.
      2. Воздействуйте на нижнюю поверхность УФ-светом еще в течение 30 мин.
      3. Промойте микроканалы 70% этанолом в течение 20 мин.
      4. Трижды промойте микроканалы стерильным PBS для удаления остатков этанола.
    2. Хранение
      1. Используйте стерилизованное устройство немедленно для экспериментов с клеточными культурами.
      2. В качестве альтернативы храните устройство, погруженным в стерильный PBS при 4°C в стерильном контейнере до использования.
        ОСТОРОЖНО: Не используйте хлорамин или другие дезинфицирующие растворы после сборки устройства, так как PDMS может абсорбировать эти соединения, что нарушит жизнеспособность клеток.

3. Оценка адгезии и жизнеспособности стволовых клеток зубного пульпы

  1. Предварительная подготовка поверхности дентина
    1. Введите 10% EDTA в устройство.
    2. Обеспечьте контакт раствора EDTA с поверхностью дентина в течение 15 мин.
    3. Вводите по 0,5 mL EDTA каждые 3 мин для поддержания движения жидкости внутри микроканала.
    4. Промойте диск дентина трижды ультрачистой водой.
    5. Проводите каждую промывку в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка EDTA удаляет смазанный слой и обнажает белки матрикса дентина.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с растворами EDTA используйте перчатки и защитные очки, чтобы избежать раздражения кожи и слизистой оболочки глаз.
  2. Посев стволовых клеток зубного пульпы
    1. Экспансия стволовых клеток зубного пульпы
      1. Посейте стволовые клетки зубного пульпы в флакон T75 с плотностью 1 × 106 клеток на флакон.
      2. Инкубируйте клетки при 37°C и 5% CO2 до достижения конфлюэнтности примерно 80%.
      3. Отделите клетки с помощью трипсина.
      4. Нейтрализуйте трипсин с помощью полной питательной среды.
      5. Центрифугируйте клеточную суспензию для получения осадка клеток.
      6. Оцените жизнеспособность клеток с помощью trypan blue.
      7. Используйте клеточные суспензии с жизнеспособностью ≥90%.
    2. Приготовление клеточной суспензии
      1. Приготовьте предварительно нагретую до 37°C клеточную суспензию.
      2. Доведите концентрацию клеток до 100 000 клеток/mL в полной питательной среде.
      3. Приготовьте конечный объем суспензии 1–2 mL.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовались клетки 5-го пассажа.
    3. Посев клеток
      1. Введите клеточную суспензию во входной порт нижнего микроканала.
      2. Переверните устройство после посева клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Переворачивание устройства способствует седиментации клеток к поверхности дентина и усиливает адгезию клеток.
    4. Инкубация
      1. Поместите перевернутое устройство в чашку Петри.
      2. Добавьте в чашку Петри 1 mL питательной среды для минимизации испарения.
      3. Инкубируйте устройство при 37°C и 5% CO2 в течение 24 ч.
      4. Поддерживайте условия статического культивирования на протяжении всего периода инкубации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Валидация динамического потока в данном исследовании не проводилась.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол описывает условия статического культивирования для первичной валидации устройства и оценки адгезии клеток.
    5. Первичная валидация устройства
      1. Оцените адгезию клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии.
      2. Извлеките диск дентина путем разборки устройства перед анализом.
  3. Подготовка образцов для сканирующей электронной микроскопии
    1. Извлечение и промывка образцов
      1. Разоберите устройство после 24 ч инкубации.
      2. Извлеките диск дентина и перенесите его в культуральную планшетку или чашку Петри.
      3. Расположите диск так, чтобы поверхность дентина с посеянными клетками была обращена вверх.
      4. Промойте диск дентина дважды, используя 1 mL PBS.
    2. Фиксация
      1. Добавьте 2 mL 2,5% глутаральдегида в 0,1 M фосфатном буфере Соренсена.
      2. Инкубируйте образец в течение 30 мин при RT.
        ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Глутаральдегид токсичен и может вызвать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Проводите процедуры фиксации в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты.
    3. Промывка после фиксации
      1. Удалите раствор глутаральдегида.
      2. Промойте диск дентина трижды ультрачистой дистиллированной водой при RT.
    4. СЭМ-анализ
      1. Проанализируйте образцы с помощью экологического сканирующего электронного микроскопа.
      2. Используйте микроскоп в условиях низкого вакуума (25 Pa).
      3. Установите ускоряющее напряжение 10,0 kV и рабочее расстояние 7,0 mm.
      4. Получите изображения, используя режим 3D-детектирования обратнорассеянных электронов (BSE-3D).
      5. Сделайте снимки при увеличении ×200 (Рисунок 2A).
  4. Оценка жизнеспособности клеток с помощью конфокальной микроскопии
    1. Подготовка образцов
      1. Посейте и культивируйте клетки, как описано в этапе 3.2.
      2. Инкубируйте устройство в течение 24 ч при 37°C и 5% CO2.
      3. Разоберите устройство и обнажите поверхность дентина.
      4. Перенесите диск дентина в планшет с лунками, содержащий предварительно нагретый HBSS+/+ с добавлением Ca2+ и Mg2+.
    2. Промывка образцов
      1. Промойте диск дентина дважды с помощью HBSS+/+.
      2. Удалите остатки сыворотки и фенолового красного перед окрашиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки сыворотки и фенолового красного могут усилить фоновую автофлуоресценцию.
    3. Окрашивание живых клеток
      1. Приготовьте свежий рабочий раствор Calcein AM в концентрации 2 µM в HBSS+/+.
      2. Добавьте достаточное количество окрашивающего раствора, чтобы полностью покрыть поверхность дентина.
      3. Инкубируйте образец в течение 20 мин при 37°C в темноте.
      4. Удалите окрашивающий раствор после инкубации.
    4. Окрашивание мертвых клеток
      1. Добавьте рабочий раствор пропидия иодида (1–2 µg/mL в HBSS+/+).
      2. Инкубируйте образец в течение 5–8 мин при 37°C в темноте.
      3. Не превышайте время инкубации более 10 мин.
      4. Промойте образец дважды с помощью HBSS+/+.
      5. Держите образец погруженным в буфер до момента визуализации.
    5. Сбор данных конфокальной микроскопии
      1. Получите конфокальные изображения в течение 30 мин после окрашивания.
      2. Последовательно получите изображения в зеленом и красном каналах.
      3. Для визуализации живых клеток используйте λex 490 nm и λem 515 nm.
      4. Для визуализации мертвых клеток используйте λex 535 nm и λem 617 nm.
        ​ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте флуоресцентные окрашивающие растворы и окрашенные образцы от воздействия света во время инкубации и процедур визуализации (Рисунок 2B).

Изображения СЭМ и флуоресцентной микроскопии; структура поверхности клеток; окрашивание тканей; клеточный анализ.
Рисунок 2: Репрезентативная оценка адгезии и жизнеспособности стволовых клеток зубного пульпы в устройстве OoC комплекса «дентин–пульпа». (A) Изображение сканирующей электронной микроскопии, демонстрирующее адгезированные стволовые клетки зубного пульпы (белая звездочка) на поверхности дентина после 24 h статического культивирования в устройстве OoC. После 24 h культивирования адгезированные клетки покрыли 54.35 ± 0.92% поверхности дентина, подверженной воздействию микроканала. Клетки не наблюдаются в области дентина, перекрытой PDMS (черная звездочка), что указывает на эффективную герметизацию между слоями устройства. Масштабный отрезок = 200 µm. (B) Изображение конфокальной микроскопии, демонстрирующее жизнеспособные стволовые клетки зубного пульпы, окрашенные в зеленый цвет и прикрепившиеся к поверхности дентина (белые стрелки) после 24 h статического культивирования. Также наблюдаются нежизнеспособные клетки, окрашенные в красный цвет (синие стрелки). Масштабный отрезок = 50 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное изготовление устройства «зуб на чипе» осуществлялось в соответствии с рабочим процессом, показанным на рисунке 1A–1I, который включал подготовку диска дентина (рисунок 1D), изготовление формы методом фотолитографии (рисунок 1E), удаление отвержденных слоев PDMS (рисунок 1F), плазменную активацию перед склеиванием (рисунок 1G), сборку конечного устройства (рисунок 1H) и подключение устройства к микрофлюидной системе (рисунок 1I). Полученное устройство представляло собой трехслойную сборку из PDMS, в которой диск дентина был полностью интегрирован в средний слой, а верхний и нижний микроканалы располагались по обе стороны от поверхности дентина (рисунок 1H).

Положительный результат на данном этапе характеризовался отсутствием видимых пузырьков воздуха или расслоений, а также герметичным прохождением жидкости после введения PBS или питательной среды через входные порты (Рисунок 1I). Смещение портов микроканала, неполное плазменное соединение или утечка на границе раздела дентин-PDMS свидетельствовали о неудачной сборке и требовали повторения процедуры изготовления.

Всего было изготовлено 30 устройств, примерно 20% из которых вышли из строя в процессе изготовления или тестирования. Отказ был в основном связан с утечкой жидкости за пределы границ микроканала из-за неполного плазменного соединения, в то время как меньшая часть отказов была вызвана расслоением в других областях устройства. Случаев отказа, связанных с утечкой на границе раздела дентин–PDMS или смещением входного и выходного отверстий микроканала, зафиксировано не было.

После 24 ч статической культуры успешное посев клеток был подтвержден наличием адгезивных стволовых клеток зубного пульпы с фибробластической морфологией на поверхности дентина. Сканирующая электронная микроскопия позволила оценить как адгезию клеток, так и целостность устройства (Рисунок 2A). При использовании данного протокола через 24 ч культивирования адгезивные клетки покрывали 54,35 ± 0,92% поверхности дентина, открытой для микроканала. Положительный результат подтверждался наличием адгезивных клеток исключительно в области микроканала, в то время как поверхность дентина, закрытая PDMS, оставалась свободной от прикрепления клеток (Рисунок 2A). Такое пространственное распределение свидетельствует об успешной герметизации между слоями устройства и правильной сборке прибора. Напротив, присутствие клеток за пределами границ микроканала указывало на утечку и должно рассматриваться как отрицательный результат.

Конфокальная микроскопия с использованием окрашивания живых/мертвых клеток позволила провести неразрушающую оценку жизнеспособности клеток внутри устройства. Успешный результат характеризовался преобладанием жизнеспособных клеток с зеленой флуоресценцией и фибробластической морфологией, при этом лишь изредка встречались нежизнеспособные клетки, окрашенные в красный цвет (Рисунок 2B). Напротив, высокая доля нежизнеспособных клеток указывала бы на субоптимальную подготовку дентина, недостаточное промывание или неподходящие условия культивирования.

В ходе оптимизации протокола была оценена первоначальная стратегия изготовления, при которой для позиционирования дентинового диска внутри среднего слоя PDMS использовалась фиксированная форма с заранее определенным углублением (Рисунок 3A). Хотя этот подход был предназначен для стандартизации размещения диска и уменьшения утечек на границе раздела диск–PDMS, на практике он оказался неэффективным. Поскольку область, соответствующая углублению для дентинового диска, приходилось вырезать из отвержденного слоя PDMS вручную, невозможно было добиться надежного и точного прилегания краев диска к срезанным краям PDMS, что приводило к образованию межфазных зазоров, вызывавших утечки примерно в 50% изготовленных устройств (Рисунок 3A).

СЭМ-анализ микрочипа; диаграмма, показывающая особенности поверхности для изучения материала при 500-кратном увеличении.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения, иллюстрирующие неудачные подходы к изготовлению, выявленные в ходе оптимизации устройства OoC комплекса «дентин-пульпа». (A) Кремниевая форма с фиксированными углублениями, предназначенными для стандартизированного размещения дисков дентина (белые стрелки). Из-за присущей вариативности размеров дисков дентина, возникшей в результате ручного приготовления образцов, не удалось достичь надежной адаптации к фиксированной геометрии формы, что привело к появлению межфазных зазоров и утечек примерно в 50% изготовленных устройств. (B) Изображение поверхности дентина, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии после нанесения герметизирующего материала на интерфейс «диск–PDMS». Указаны открытый дентин (черная звездочка) и отложения герметизирующего материала (белая звездочка). Непреднамеренное распространение герметизирующего материала по поверхности дентина нарушило адгезию клеток и уменьшило площадь поверхности, доступную для колонизации клеток. Масштабная линейка = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы устранить этот недостаток, на границе раздела между диском и PDMS был нанесен герметизирующий материал. Однако этот подход привел к возникновению дополнительной проблемы: герметик растекся по поверхности дентина и препятствовал адгезии клеток в покрытых областях, что было продемонстрировано с помощью сканирующей электронной микроскопии (Рисунок 3B). Эти неудовлетворительные результаты выявили два критических ограничения первоначальной стратегии изготовления: недостаточное прилегание вырезанного вручную углубления в PDMS к диску дентина и снижение адгезии клеток, связанное с использованием герметизирующего материала.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании представлен пошаговый протокол изготовления устройства «зуб на чипе» с вертикальным стеком, включающего дентин и стволовые клетки зубного пульпы, а также продемонстрированы репрезентативная адгезия и жизнеспособность клеток внутри устройства в условиях статического культивирования. Протокол был разработан для обеспечения воспроизводимого рабочего процесса изготовления и сборки платформы «орган-на-чипе» (OoC) комплекса дентин–пульпа, подходящей для исследований интерфейса дентина in vitro. Создание такого рабочего процесса особенно значимо, поскольку наш недавний систематический обзор показал, что область микрофлюидных моделей комплекса дентин–пульпа все еще находится на начальном этапе развития и характеризуется высокой методологической неоднородностью архитектуры и материалов устройств, что серьезно препятствует воспроизводимости и стандартизации современных моделей «зуб на чипе»34. Предоставляя подробный и воспроизводимый протокол, данное исследование устраняет эти ограничения и способствует разработке более четко определенных биологических моделей. В более широком контексте разработки OoC, примененных в биологии полости рта, França et al.15 стали первопроходцами в этой области, создав микрофлюидную модель «зуб на чипе», включающую диски дентина и одонтобластоподобные клетки, что продемонстрировало возможность воссоздания интерфейса дентин–пульпа в динамической микрофлюидной среде и оценки цитотоксического ответа на стоматологические материалы. С момента этого фундаментального вклада в литературе было описано растущее число платформ OoC для полости рта34, затрагивающих различные аспекты биологии зубных тканей, взаимодействия с биоматериалами, а также микробиологии полости рта, что утвердило данный подход как активную и быстро развивающуюся область исследований. Настоящий протокол дополняет эту область, предоставляя подробный и воспроизводимый процесс изготовления платформы «зуб на чипе» с вертикальным стеком, доступный для исследовательских групп со стандартным микрофлюидным оборудованием.

Несколько этапов протокола имеют решающее значение для успешного изготовления и функционирования устройства. В частности, заливка PDMS на форму требует тщательного контроля для получения однородной толщины слоя и правильного формирования микроканалов. Толщину слоев PDMS следует выбирать в соответствии с предполагаемым дальнейшим применением. Например, для конфокальной микроскопии требуются достаточно тонкие слои PDMS, чтобы обеспечить оптическую визуализацию клеток, прикрепившихся к поверхности дентина. Однако с более тонкими слоями может быть сложнее работать в процессе изготовления и сборки. Следовательно, оптимизация толщины PDMS представляет собой важный баланс между доступностью визуализации и практическим удобством манипуляций при изготовлении устройства. Кроме того, в данном исследовании конфокальная микроскопия неповрежденных устройств была невозможна, поскольку слой PDMS над клетками имел толщину 0.4 mm, что превышало глубину проникновения имеющегося конфокального микроскопа (0.2 mm). В результате конфокальная визуализация проводилась после разборки устройства и прямого воздействия на поверхность дентина. Кроме того, флуоресцентная микроскопия не была применима для данного устройства, так как естественная непрозрачность дентина препятствовала прямой оптической визуализации клеток, прикрепленных к его поверхности.

Данное ограничение особенно актуально для вертикально ориентированных конфигураций OoC, в которых микроканал с клетками расположен под дентиновым диском, в результате чего оптический доступ затруднен как вышележащим слоем PDMS, так и непрозрачностью самого дентина. Это ограничение отсутствует в конструкциях чипов с горизонтальным расположением, где микроканалы проходят латерально рядом с дентином, а не под ним, что обеспечивает прямой оптический доступ к поверхности с посеянными клетками без помех со стороны непрозрачности дентина или толщины PDMS. Таким образом, при выборе между вертикальной и горизонтальной конфигурациями следует учитывать не только гидродинамические и биологические требования, но и имеющиеся в лаборатории методы визуализации. В системе OoC конструкция устройства играет важную роль, и микроокружение должно поддерживаться максимально близко к условиям in vivo. Как и большинство тканей, зуб подвергается воздействию механических стимулов и проявляет анизотропное поведение35, что означает, что его свойства меняются в зависимости от направления приложенного стимула. Кроме того, существуют гистологические различия между коронной частью дентинно-пульпарного комплекса, где дентин и одонтобласты расположены вертикально, и латеральной частью, где одонтобласты находятся рядом с дентином; при этом наблюдаются заметные различия в количестве клеток, их организации и ориентации дентинных трубочек. Таким образом, конструкция чипа с вертикальным расположением обеспечивает более точное анатомическое представление кариозных поражений и реставрационных материалов, воздействующих на коронную часть дентинно-пульпарного комплекса.

Точная обработка поверхности плазмой имеет решающее значение для успешной сборки устройств и остается одной из основных проблем при производстве чипов36. В данном исследовании расслоение произошло в 20% изготовленных устройств. Этот результат не является неожиданным, поскольку склеивание PDMS–PDMS, осуществленное с помощью ручки с плазменным разрядом, использованной в настоящем исследовании, создает более низкую концентрацию активных форм кислорода, чем вакуумные плазменные камеры, в которых поддерживается концентрация кислорода выше атмосферного уровня, что, следовательно, приводит к образованию большего количества ковалентных поверхностных групп, доступных для связывания36. В результате прочность соединения, достигаемая при использовании плазменной ручки, по определению ниже и менее воспроизводима, чем при использовании специализированной плазменной камеры, что, вероятно, способствовало наблюдаемой частоте расслоения. Оптимизация стратегии интеграции дентина также потребовала нескольких итераций изготовления для достижения плотного контакта между диском дентина и средним слоем PDMS при минимизации утечек. Первоначальный подход заключался в создании в среднем слое заранее определенного углубления для размещения дентина; однако ручное вырезание углубления препятствовало стабильному прилеганию краев PDMS к диску дентина, что приводило к утечкам при введении питательной среды и обеспечивало общий уровень успеха изготовления примерно 50%.

Впоследствии была протестирована адгезивная паста для зубных протезов с целью улучшения герметизации границы раздела дентин–PDMS, однако сканирующая электронная микроскопия показала, что она препятствует адгезии клеток и ухудшает их визуализацию на поверхности дентина. В связи с этим итоговый протокол был оптимизирован путем размещения диска дентина непосредственно в форме перед аккуратным заливанием PDMS вокруг образца, что улучшило интеграцию диска дентина в устройстве и снизило необходимость в дополнительных герметиках. Такой подход эффективно устранил утечки на границе раздела дентин–PDMS, обеспечив плотный и конформный контакт между краями диска дентина и окружающим PDMS без использования вспомогательных герметизирующих агентов, которые могли бы помешать адгезии клеток к поверхности дентина. Также следует учитывать несколько ограничений данного метода. Изготовление микрофлюидных устройств частично остается зависимым от ручных манипуляций, что может привести к вариабельности между устройствами и операторами. Хотя фотолитография обеспечивает высокую точность и воспроизводимость при создании геометрии микроканалов, этот процесс может потребовать специализированного оборудования и технических знаний. Альтернативные подходы к изготовлению, включая методы трехмерной печати, могут облегчить прототипирование устройств и сделать их более доступными для некоторых лабораторий; однако такие факторы, как разрешение печати, остаточные мономеры и биосовместимость материалов, требуют тщательной оптимизации37.

Непрерывная подача среды обеспечивает клеткам стабильную среду и защищает их от накопления продуктов обмена или дисбаланса кальция и фосфатов16. Ряд исследований показал, что напряжение сдвига, вызванное постоянным потоком, может имитировать процессы механотрансдукции, аналогичные сигнализации in vivo, которые являются ключевыми детерминантами поведения клеток38,39, способствуя дифференцировке и созреванию клеток, а также вызывая значительные изменения в морфологии, экспрессии генов и функциях клеток39. В данной работе описываются изготовление и первичная валидация устройства, демонстрирующие адгезию и жизнеспособность клеток через 24 h в условиях статического культивирования; следовательно, эффекты динамического потока не оценивались. Внедрение условий динамического потока представляет собой важное направление для будущих исследований и будет рассмотрено в последующих работах. Настоящий протокол описывает воспроизводимый рабочий процесс изготовления устройства OoC с вертикально расположенным комплексом дентин-пульпа, включающего дентин в трехслойной микрофлюидной платформе из PDMS. Потенциальные области применения модели включают исследование взаимодействий между дентином и биоматериалами, клеточных ответов на стоматологические материалы и оценку интерфейса дентин-пульпа in vitro в контролируемых экспериментальных условиях.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов и конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данная работа была поддержана проектами DIM24-0004 и PP24-0031 управления по исследованиям (Dirección de Investigación) Университета Ла-Фронтера; грантом FONDECYT Regular № 1260116 и грантом FONDECYT de Iniciación № 11230701 Национального агентства по исследованиям и разработкам (ANID), Чили.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Биологические и химические материалы
АцетонExpertQSOLV 8Очистка кремниевой пластины
Культуральная среда Alpha MEMCytivaSH30265.02Среда для культивирования стволовых клеток зубного пульпы
Хлорамин (0,5%)Merck7080-50-4Раствор для хранения дисков дентина
Стволовые клетки зубного пульпыНе применимоНе применимоПервичная культура клеток. См. этапы 3.2.1 и 3.2.2
ЭДТА (10%)WinklerN2222158EУдаление смазочного слоя
Негативный фоторезист на эпоксидной основеGersteltecGM1060Изготовление формы методом фотолитографии
Глутаральдегид (2,5%) в 0,1 M фосфатном буфере Соренсена’Sigma-Aldrich210908-06Фиксация для СЭМ
Здоровые зубы человека (моляры или премоляры)Не применимоНе применимоОбразец человека
ИзопропанолExpertQSOLV 16Очистка пластин, остановка проявления и очистка PDMS
Набор для определения жизнеспособности LIVE/DEADSigma-Aldrich451Флуоресцентное окрашивание жизнеспособности. 
PBS (фосфатно-солевой буфер)Corning46-013-CMПромывка и тестирование на утечки
Основа PDMS и отвердитель (полидиметилсилоксан)DowSylgard 184Изготовление устройства
PGMEASigma Aldrich484431Проявление фоторезиста
Трипановый синийSigma Aldrich T8154-100mlОценка жизнеспособности клеток
ТрипсинCorning25-053-CIОткрепление клеток
Ультрачистая водаCytivaSH30529.01Раствор для промывки
Расходные материалы и лабораторная посуда
Иглы для шприцев 19GVmaticVCB19050Соединение устройства с микронасосом или шприцем
Биопсийный панч (диаметр: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Изготовление входного и выходного портов
Коврик для резкиNicecoolНе применимоЗащита поверхности при вырезании
Стоматологические отделочные диски (например, Sof-Lex)3MSof-LexПолировка дентина
Переходники с Luer на штуцер (female)Runze FluidicsRH-M016Соединение трубок
Стеклянная или пластиковая палочка для перемешиванияDuranНе применимоПеремешивание PDMS
Подкожные шприцыCranberrypc-12246Посев клеток и тестирование на утечки
Стерильная марля без ворсаLindersonНе применимоУдаление остатков после вырезания
Переходники Luer (male)Runze FluidicsRH-G016Соединение трубок
Сосуд для смешиванияDuranНе применимоПриготовление PDMS
Чашка Петри (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Культивирование клеток/инкубация
Политетрафторэтиленовая основаCCTValНе применимоИзготовление промежуточного слоя дентина
Кремниевая пластинаJiaozuo Commercial FineWinНе применимоИзготовление формы
Силиконовая трубкаRunze Fluidics96421Жидкостное соединение
Флакон T75Corning 353136Экспансия стволовых клеток зубного пульпы
Многолуночный планшетSPL Life Sciences30006Конфокальное окрашивание и подготовка к визуализации
Оборудование и инструменты
Осушитель воздухаMETALPLANTITAN-040Осушка сжатого воздуха
Источник сжатого воздухаSCHULZCSD-18.1Очистка формы и поверхности
Конфокальный микроскопOlympusНе применимоМодель: FV1000
Система прямой лазерной литографииHeidelberguPG 101Экспонирование фоторезиста
Экологический сканирующий электронный микроскопHitachiНе применимоМодель: Quanta 400 
Высокоскоростной наконечникNakanishiНе применимоМодель: Pana-max2
Плитка подогреваLabTechEH20A PlusЗапекание пластины и фоторезиста
Ламинарный шкафBioBaseBBS8V1708313DСтерилизация устройства
Микрофлюидный насосNew EraНе применимоМодель: 1002X-ES. Тестирование на утечки при 10 µL/min
Микроструктурированная форма (изготовленная методом фотолитографии)CCTValНе применимоСпецификации изготовления формы см. в этапе 2.2
Печь или инкубаторMemmertUN110Отверждение PDMS при 50°C и консолидация связи при 75°C
Вакуумная камера для плазменной очисткиFari PlasmaGD-5Плазменная активация пластины
Ручной коронный плазмотрон Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACПлазменная активация PDMS
Ультразвуковой очистительElma SonicS 10 (H)Очистка пластины
Вакуумная камера или эксикатор (250 mm)WinglassНе применимоДегазация PDMS
Вакуумный насосROCKER300Дегазация PDMS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи