Экспрессия белка-ридера m6A YTHDC2 при немелкоклеточном раке легкого в китайской клинической когорте

Краткое содержание

В данном исследовании с помощью биоинформатики и qRT-PCR оценивается экспрессия YTHDC2 при немелкоклеточном раке легкого. В то время как анализ баз данных указывает на снижение экспрессии и прогностическую значимость, клиническая валидация не выявила существенных различий. Полученные результаты подчеркивают наличие противоречий, что свидетельствует об ограниченной диагностической точности и необходимости дальнейшей валидации перед применением в клинической практике.

Аннотация

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) остается одной из ведущих причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире, при этом количество доступных биомаркеров для ранней диагностики и прогнозирования ограничено. Модификация РНК N6-метиладенозина (m6A) и ее белки-ридеры, такие как YTHDC2, играют критическую роль в регуляции генов и туморогенезе. Данное исследование направлено на оценку профиля экспрессии YTHDC2 в тканях НМРЛ с помощью биоинформатики и количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР), анализ взаимосвязи между YTHDC2 и клинико-патологическими характеристиками, а также изучение его потенциальной клинической и биологической значимости для будущих исследований. Для определения прогностической точности были проанализированы данные об экспрессии генов и выживаемости из баз данных. Экспрессия YTHDC2 была количественно определена в тканях НМРЛ в китайской клинической когорте, и были проанализированы клинико-патологические характеристики. Анализ публичных баз данных показал, что экспрессия YTHDC2 была снижена в тканях НМРЛ (p < 0.05) и была связана с выживаемостью пациентов, хотя его прогностическая эффективность была низкой (AUC ≈ 0.5). Анализ методом кПЦР 19 пар опухолевых и прилежащих нормальных тканей не выявил статистически значимых различий (p = 0.537) в экспрессии YTHDC2 между раковыми и прилежащими тканями. В совокупности анализ публичных баз данных позволяет предположить, что экспрессия YTHDC2 может быть снижена и иметь потенциальное прогностическое значение при НМРЛ, однако независимая клиническая валидация в нашей когорте не подтвердила значимой дифференциальной экспрессии. Эти результаты подчеркивают существенную гетерогенность между крупномасштабными наборами данных и реальными когортами, указывая на то, что YTHDC2 вряд ли может служить надежным самостоятельным диагностическим или прогностическим биомаркером и может потребовать интеграции с дополнительными молекулярными маркерами для клинического применения.

Введение

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), включающий плоскоклеточный рак и аденокарциному, является наиболее часто диагностируемым видом рака легкого и одной из главных причин смертности от онкологических заболеваний в мире¹. Согласно глобальной статистике, рак легкого входит в число основных причин смерти от рака². Последние достижения в области диагностики, хирургии, лучевой терапии и молекулярно-таргетной терапии не привели к значительному улучшению прогноза при НМРЛ, поскольку первичный диагноз обычно ставится на поздней стадии, а на ранних этапах заболевание часто протекает бессимптомно³. Это подчеркивает необходимость поиска новых биомаркеров для идентификации, прогнозирования и оценки эффективности лечения пациентов с НМРЛ.

m6A — это первая выявленная и наиболее распространенная модификация РНК у эукариот, которая играет роль в стабильности, трансляции и транскрипции РНК⁴. Модификации m6A динамичны и обратимы; этот процесс обеспечивается метилтрансферазами («писателями»), деметилазами («стирателями») и специфическими связывающими белками («ридерами»)⁵. Среди них YTHDC2, основной белок-ридер m6A, модулирует стабильность РНК и скорость трансляции⁶. Недавние исследования указывают на то, что YTHDC2 участвует в регуляции различных типов рака, либо подавляя рост и инвазию клеток, либо индуцируя их гибель⁷. В ряде работ также подчеркивается клиническая значимость других белков-ридеров m6A, включая YTHDF1, YTHDF2 и YTHDC1, в прогрессировании рака легкого, иммунной регуляции и прогнозе заболевания, что подтверждает важность систематической оценки отдельных ридеров m6A в независимых когортах пациентов^8,9,10. При НМРЛ наблюдается значительное снижение уровней YTHDC2, что ассоциировано с высокими стадиями опухоли, метастазированием в лимфатические узлы и плохим прогнозом для пациентов, что указывает на его возможную роль в качестве антиопухолевого фактора¹¹. Эксперименты in vitro и in vivo также показывают, что высокая экспрессия YTHDC2 ингибирует пролиферацию и метастазирование клеток при раке легкого⁷.

В данном исследовании регуляция YTHDC2 при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) изучалась с помощью комплексного вычислительного анализа и экспериментальной валидации методом qRT-PCR. Также была исследована взаимосвязь между экспрессией YTHDC2, клинико-патологическими характеристиками и прогнозом для пациентов. Несмотря на растущий объем данных из открытых баз, указывающих на нарушение регуляции YTHDC2 при НМРЛ, в опубликованных работах приводятся противоречивые данные относительно масштабов и клинической значимости этой дисрегуляции, а независимая валидация на хорошо охарактеризованных реальных клинических когортах, особенно в азиатских популяциях, остается ограниченной. Более того, большинство предыдущих исследований опирались преимущественно на открытые транскриптомные наборы данных или экспериментальные модели, и лишь немногие интегрировали биоинформатические результаты с независимой клинической валидацией. Путем сочетания крупномасштабного анализа открытых транскриптомных данных с независимой валидацией методом qRT-PCR в китайской клинической когорте данное исследование было направлено на оценку воспроизводимости предыдущих результатов и устранение разрыва между анализом открытых баз данных и реальными клиническими образцами. Таким образом, целью данной работы была систематическая оценка экспрессии YTHDC2 с использованием интегрированных подходов биоинформатики и клинической валидации, а также определение ее потенциальной биологической и клинической значимости при НМРЛ. Была выдвинута гипотеза о том, что экспрессия YTHDC2 нарушена при НМРЛ и что интеграция биоинформатического анализа с независимой клинической валидацией обеспечит более надежную оценку ее диагностического и прогностического значения, чем любой из этих подходов по отдельности.

Протокол

Исследование было одобрено Этическим комитетом Хайнаньского медицинского университета (номер одобрения HMC1984.24) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией (в редакции 2013 года).

Объекты исследования

Исследование 50 пациентов с раком легкого, диагностированных в период с 2017 по 2024 год в Центральной больнице города Санья в провинции Хайнань, проводилось в соответствии с Клиническими рекомендациями Китайской медицинской ассоциации по диагностике и лечению рака легкого (издание 2024 года). Стадирование по системе CSCO (2024) было приведено в соответствие с 8-м изданием AJCC для обеспечения сопоставимости результатов с другими исследованиями, что было подтверждено в китайских когортах¹²; для обеспечения согласованности данных результаты были проверены двумя независимыми онкологами. Процесс отбора пациентов, доступность тканей, оценка качества РНК и окончательный подбор образцов для анализа методом qRT-PCR обобщены на Рисунке 1.

Данные исследования

В данном исследовании использовались методы биоинформатики для анализа уровней экспрессии YTHDC2 при НМРЛ и их связи с клинико-патологическими характеристиками, что позволило получить представление о потенциальных механизмах. Биоинформатический анализ проводился исключительно с использованием общедоступных данных секвенирования РНК из The Cancer Genome Atlas (TCGA), включая образцы аденокарциномы легкого (LUAD), плоскоклеточного рака легкого (LUSC) и соответствующих образцов нормальной ткани легкого, загруженных через портал данных GDC (https://portal.gdc.cancer.gov/). Загруженный набор данных включал данные об экспрессии при секвенировании РНК вместе с имеющимися клиническими переменными (идентификатор пациента, идентификатор образца, возраст, пол, патологическая стадия, статус выживаемости и общая продолжительность выживания) для подходящих случаев TCGA-LUAD и TCGA-LUSC. Образцы, для которых отсутствовала информация об экспрессии генов или выживаемости, были исключены из последующего анализа выживаемости и ROC-анализа. Набор данных, использованный в этом исследовании, представлен в Дополнительном файле 1. Клинические образцы, собранные в Центральной больнице города Санья, для биоинформатического анализа не использовались. Подробные процедуры анализа с помощью GEPIA, Kaplan–Meier Plotter и survivalROC приведены ниже в разделе «Биоинформатический анализ». Полный рабочий процесс биоинформатического анализа, включая получение данных, предварительную обработку, анализ экспрессии генов, анализ выживаемости и ROC-анализ, обобщен на Рисунке 2.

Критерии включения и исключения

Критерии включения и исключения пациентов представлены в Таблице 1. Анализ мощности с использованием специализированного программного обеспечения показал, что для обеспечения 80% мощности при выявлении умеренного размера эффекта (d = 0.8, α = 0.05, двусторонний критерий) потребуется не менее 26 случаев в каждой группе. Хотя изначально планировалось включить 50 пар в группу с раком легкого, в окончательный анализ qRT-PCR вошли 30 образцов опухоли и 19 образцов прилежащей нормальной ткани после исключения проб с неудовлетворительным качеством ткани или РНК. Такое сокращение размера выборки отражает реальные клинические ограничения и подчеркивает важность целостности РНК и доступности тканей в трансляционных исследованиях. При n = 19 для сравнений минимальный обнаруживаемый размер эффекта составляет d = 1.0 (мощность 80%, α = 0.05). Таким образом, мощность эксперимента была достаточной для выявления значительных, но не малых или умеренных различий в экспрессии YTHDC2.

Образцы тканей и количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР-РВ)

Патологоанатомические диагнозы были определены двумя разными патологами методом двойного слепого исследования. Чистота опухоли оценивалась патологами (>70% злокачественных клеток) и подтверждалась с помощью ESTIMATE (TCGA). Прилежащие нормальные ткани подвергались макродиссекции для минимизации контаминации стромой. Гистологические типы рака легкого включали аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак: 26 случаев аденокарциномы легкого и 4 случая плоскоклеточного рака. Клиническое стадирование 50 пациентов с раком легкого проводилось в соответствии с критериями стадирования, изложенными в «Клинических рекомендациях Китайской медицинской ассоциации по раку легкого (издание 2024 года)». Патологически подтвержденные образцы НМРЛ (n = 50) соответствовали типичному клиническому распределению (см. Таблицу 2). Из 50 первоначально включенных пациентов критериям качества РНК соответствовали 30 образцов опухолевой ткани и 19 соответствующих образцов прилежащей нормальной ткани. Поскольку парный статистический анализ требует соответствующих образцов от одного и того же пациента, сравнение экспрессии в опухоли и прилежащей нормальной ткани проводилось с использованием 19 доступных соответствующих пар. Эти клинические образцы использовались исключительно для экспериментальной валидации методом qRT-PCR и анализировались независимо от публичных наборов данных TCGA, использованных для биоинформатического анализа. Отобранные образцы обрабатывались сразу после патологического подтверждения и обрабатывались в условиях отсутствия РНказ перед экстракцией РНК. Данная подгруппа отражает случаи, в которых удалось получить как достаточное количество ткани, так и высококачественную общую РНК (индекс целостности РНК, RIN >7.0). Концентрация и чистота общей РНК измерялись перед обратной транскрипцией, и для последующего анализа включались только образцы с адекватным качеством РНК (RIN >7.0). Равные количества общей РНК подвергались обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) в соответствии с протоколом производителя перед количественной ПЦР. Этот процесс обеспечил достоверность проанализированных данных экспрессии генов. Эксперименты qRT-PCR проводились на термоциклере для ПЦР в реальном времени с использованием зондового метода количественной ПЦР. Все реакции проводились в трех повторностях вместе с контролем без матрицы для обеспечения аналитической воспроизводимости. Амплификация ПЦР проводилась при следующих условиях циклирования: начальный этап активации фермента/денатурации при 95°C в течение 10 min, затем 40 циклов денатурации при 95°C в течение 15 s и отжига/элонгации при 60°C в течение 60 s. Сигналы флуоресценции регистрировались в конце каждого цикла амплификации. Все реагенты и расходные материалы были получены от коммерческих поставщиков (см. Таблицу материалов). Последовательности праймеров и зондов, использованных в qRT-PCR, приведены в Таблице 3.

Биоинформационный анализ

Анализ экспрессии гена YTHDC2 с помощью базы данных GEPIA

Для анализа экспрессии YTHDC2 при НМРЛ использовали базу данных GEPIA. Доступ к веб-серверу GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) осуществлялся через веб-браузер. Был выбран модуль Expression DIY, введен символ гена "YTHDC2", выбраны наборы данных LUAD и LUSC, сохранены стандартные параметры нормализации, и непосредственно через интерфейс GEPIA были построены диаграммы размаха (box plots) дифференциальной экспрессии. Статистическая значимость определялась как p < 0.05.

База данных Kaplan-Meier plotter для анализа выживаемости пациентов с раком легкого

В данном исследовании с помощью базы данных Kaplan-Meier Plotter анализировалась связь между экспрессией YTHDC2 и прогнозом у пациентов с раком легкого. Был выбран набор данных по раку легкого, введен символ гена "YTHDC2", применена опция автоматического выбора оптимального порогового значения (best cutoff), и с использованием стандартных настроек анализа были построены кривые Каплана-Мейера для общей выживаемости и выживаемости после прогрессирования. Пациенты были автоматически разделены на группы с высокой и низкой экспрессией с использованием оптимального порога, определенного платформой Kaplan-Meier Plotter; показатели отношения рисков с соответствующими 95% доверительными интервалами были рассчитаны с использованием настроек платформы по умолчанию.

Запуск пакетов R в программном обеспечении R для построения ROC-кривых

Данные об экспрессии, полученные путем секвенирования РНК, и соответствующие клинические метаданные по подходящим случаям TCGA-LUAD и TCGA-LUSC были загружены с портала данных GDC. Загруженные наборы данных были объединены по идентификатору пациента и импортированы в R для последующего анализа. Пакет survivalROC использовался для построения зависящих от времени ROC-кривых для временных точек прогноза 1, 3 и 5 лет; для оценки прогностической значимости экспрессии YTHDC2 рассчитывались соответствующие значения площади под кривой (AUC). В анализ выживаемости с помощью ROC-кривых были включены только пациенты TCGA-LUAD и TCGA-LUSC, для которых имелись данные экспрессии RNA-seq и сведения о выживаемости. Локальная клиническая когорта не использовалась для прогнозирования выживаемости из-за отсутствия данных долгосрочного наблюдения.

Определение экспрессии YTHDC2 в тканях методом qRT-PCR

Для анализа уровней экспрессии генов была проведена qRT-PCR. В каждую реакцию добавляли равные объемы кДНК в соответствии с условиями реакции, рекомендованными производителем. Амплификацию проводили с использованием количественного ПЦР-анализа на основе зондов, а данные флуоресценции регистрировались автоматически в конце каждого цикла амплификации. Вкратце, процесс экстракции РНК включал несколько этапов, в том числе подготовку образца, депарафинизацию, удаление остатков жидкости, переваривание протеиназой K, инкубацию, центрифугирование, обработку ДНКазой, добавление DNase I и осаждение этанолом. Затем образец связывали с колонкой для очистки РНК на основе силикагеля и центрифугировали при 8,000 × g в течение 30 s. Затем колонку промывали промывочным буфером 1, промывочным буфером 2 и промывочным буфером 2, разведенным этанолом, и высушивали при 13,000 × g в течение 2 min. РНК затем элюировали, добавив 70 µL воды, свободной от РНКаз, в центр мембраны колонки, с последующим центрифугированием при 13,000 × g в течение 1 min. Каждая пара праймеров дала один продукт амплификации, что было подтверждено анализом кривых плавления перед расчетом относительной экспрессии генов. Эффективность праймеров (90–110%) была подтверждена с помощью стандартных кривых перед анализом образцов. Анализ кривых плавления подтвердил наличие одиночных ампликонов и отсутствие димеров праймеров. Относительная экспрессия YTHDC2 рассчитывалась методом 2^-ΔCt, при котором значения Ct были нормализованы по эндогенному референсному гену GAPDH. Поскольку значения экспрессии были представлены как нормализованные уровни экспрессии, а не как кратность изменения относительно калибровочного образца, результаты сообщаются в виде значений 2^−ΔCt. GAPDH был выбран в качестве ген-контроля (housekeeping gene), так как его экспрессия демонстрировала минимальную вариабельность (CV < 5%) по сравнению с протестированными альтернативами (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), что соответствует критериям выбора референсного гена в исследованиях m6A.

Статистический анализ

Статистический анализ, включая построение графиков и диаграмм, выполнялся с помощью специализированного программного обеспечения. Для анализа количественных и категориальных данных об экспрессии гена YTHDC2 у пациентов с НМРЛ, а также для биоинформатического анализа и построения ROC-кривых использовалось программное обеспечение R. ROC-кривые и показатель AUC применялись для оценки диагностической эффективности экспрессии YTHDC2 в прогнозировании выживаемости. Для регрессионного анализа, где это было применимо, приводились оценки эффекта (отношение шансов) с соответствующими 95% доверительными интервалами. Для сравнения экспрессии YTHDC2 в парных образцах опухоли и прилегающей нормальной ткани использовался критерий знаковых рангов Вилкоксона, а для оценки связи между экспрессией YTHDC2 и клинико-патологическими характеристиками — корреляционный анализ Пирсона. Приводились коэффициенты корреляции (r) и соответствующие значения p. Поскольку данные qRT-PCR состояли из парных образцов опухоли и прилегающей нормальной ткани от одних и тех же пациентов, а данные об экспрессии генов не имели нормального распределения, для сравнения уровней экспрессии YTHDC2 между парными тканями применялся критерий знаковых рангов Вилкоксона. Данный критерий не предполагает нормальности распределения данных и широко используется для анализа асимметричных биологических данных. Все статистические тесты были двухсторонними, и значение p <0,05 считалось статистически значимым. Перед анализом количественные переменные проверялись на нормальность распределения. Количественные переменные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения или медианы (межквартильный размах) в зависимости от ситуации.

Результаты

Экспрессия гена YTHDC2 в опухолях на основе базы данных TCGA

Рисунок 3 иллюстрирует связь между NSCLC и YTHDC2 путем анализа уровней экспрессии YTHDC2 при различных видах рака с использованием инструмента GDC в базе данных TCGA.

Экспрессия гена YTHDC2 при НМРЛ в базе данных GEPIA

483 образцов ткани аденокарциномы легкого, 347 образцов нормальной ткани легкого, 486 образцов ткани плоскоклеточного рака легкого и 338 образцов нормальной ткани легкого были получены в результате дополнительного скрининга уровней экспрессии YTHDC2 при аденокарциноме легкого (LUAD) и плоскоклеточном раке легкого (LUSC) с использованием базы данных GEPIA. Статистический анализ показал, что в тканях как аденокарциномы, так и плоскоклеточного рака легкого уровни экспрессии YTHDC2 были значительно ниже, чем в нормальных тканях легкого (p < 0.05), что проиллюстрировано на Рисунке 4.

Анализ экспрессии YTHDC2 на разных патологических стадиях с помощью GEPIA

Для построения графика стадий с целью оценки дифференциальной экспрессии YTHDC2 на разных стадиях НМРЛ была использована база данных GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis). Как показано на Рисунке 5, статистически значимых различий в экспрессии YTHDC2 между патологическими стадиями НМРЛ выявлено не было (p = 0.644).

Анализ Каплана-Мейера выживаемости при раке легкого в зависимости от YTHDC2

Для проведения анализа выживаемости Каплана-Мейера для гена YTHDC2 была использована база данных Kaplan-Meier Plotter. Согласно полученным результатам, пациенты с высоким уровнем экспрессии YTHDC2 имели значимо более высокую общую выживаемость (OS), чем пациенты с низкой экспрессией (p < 0.05). Как показано на Рисунке 6A (OS), пациенты с раком легких с более высоким уровнем экспрессии YTHDC2 имели лучший прогноз, и эта разница была статистически значимой (p < 0.05). Согласно Рисунку 6B (PPS), в наборе данных по выживаемости после прогрессирования (PPS) группа с высокой экспрессией YTHDC2 имела лучший прогноз, чем группа с низкой экспрессией; разница была статистически значимой (p < 0.05).

Модель прогнозирования выживаемости YTHDC2

Зависимый от времени ROC-анализ на основе данных экспрессии РНК-секвенирования и выживаемости из TCGA выявил ограниченную прогностическую способность только экспрессии YTHDC2 для выживаемости при НМРЛ, при этом значения AUC составили 0,50 (95% ДИ: 0,38-0,62), 0,51 (95% ДИ: 0,39-0,63), 0,52 (95% ДИ: 0,40-0,64) и 0,52 (95% ДИ: 0,39–0,65) через 1, 3, 5 и 8 лет соответственно (Рисунок 7). Все доверительные интервалы AUC включали значение 0,5, что указывает на эффективность, эквивалентную случайному шансу. Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия YTHDC2 сама по себе не обладает дискриминационной способностью для прогнозирования выживаемости и не должна рассматриваться как самостоятельный прогностический биомаркер. Интеграция с клинико-патологическими переменными или мультигенными сигнатурами может улучшить прогностическую точность.

Экспрессия YTHDC2 в раковых и нормальных тканях, определенная методом qRT-PCR

Экспрессия гена YTHDC2 была исследована в злокачественных тканях и прилегающих нормальных тканях пациентов с НРРЛ методом qRT-PCR. Нормализованная экспрессия YTHDC2 (2^−ΔCt) составила 3,24 ± 2,34 в злокачественных тканях и 3,60 ± 1,70 в близлежащих нормальных тканях. Между 19 парами образцов опухолевых тканей при НРРЛ и соответствующими им прилегающими нормальными тканями не было обнаружено значимой разницы в экспрессии YTHDC2 (p = 0,537), что показано на Рисунке 8. В то время как биоинформатический анализ больших наборов данных указывал на значительное снижение экспрессии YTHDC2 при НРРЛ, qRT-PCR в нашей когорте не выявил значимых различий, что подчеркивает возможные расхождения, обусловленные размером когорты, гетерогенностью образцов и технической вариабельностью. Кроме того, низкое значение AUC (0,5) указывает на то, что YTHDC2 сам по себе не обладает диагностической или прогностической точностью.

Экспрессия YTHDC2 и клинико-патологические характеристики при НМРЛ

В данное исследование было включено 50 человек с НМРЛ. Среди них было 32 пациента мужского пола (64,00%) и 18 пациентов женского пола (36,00%), средний возраст которых составил 63,10 ± 9,85 лет. Возраст участников варьировался от 37 до 86 лет. 25 пациентов курили в прошлом, и 25 никогда не курили. Среди патологических типов встречались девять случаев плоскоклеточного рака (18,00%) и сорок один случай аденокарциномы легкого (82,0%). Согласно клиническому стадированию CSCO, 22 пациента находились на III–IV стадиях (44,00%), а 28 — на I–II стадиях (56,00%). У двадцати четырех пациентов метастазы в лимфатических узлах отсутствовали, в то время как у двадцати шести человек (54,00%) они были выявлены. У девяти пациентов наблюдался низкодифференцированный рак (18,00%), а у 41 пациента — высоко- или умеренно дифференцированные опухоли (82,00%).

Была изучена связь между клинико-патологическими характеристиками и уровнями экспрессии YTHDC2 в тканях НМРЛ. Различия в экспрессии YTHDC2 наблюдались между патологическими подтипами и в зависимости от статуса метастазирования в лимфатические узлы (p < 0.05). Однако, поскольку было доступно всего четыре образца плоскоклеточного рака, результаты сравнения патологических подтипов следует интерпретировать с осторожностью и рассматривать как предварительные. Как показано на рисунках 9A, B, экспрессия YTHDC2 была значительно выше при плоскоклеточном раке, чем при аденокарциноме легкого, и значительно выше в тканях НМРЛ с метастазами в лимфатические узлы, чем в тканях без таких метастазов (5.70 ± 2.53 против 3.83 ± 0.91, p = 0.027). Тем не менее, из-за включения всего четырех образцов плоскоклеточного рака сравнение между патологическими подтипами следует интерпретировать с осторожностью и считать предварительным до подтверждения на более крупных когортах. Более высокая экспрессия YTHDC2 у пациентов с метастазами в лимфатические узлы может указывать на потенциальную связь между YTHDC2 и статусом лимфогенного метастазирования; однако этот результат следует интерпретировать с осторожностью ввиду ограниченного размера выборки, и он требует валидации на более крупных независимых когортах. При этом возраст, анамнез курения, клиническая стадия по CSCO и гистологическая дифференцировка не оказывали значимого влияния на экспрессию YTHDC2 (p > 0.05). Дополнительная информация представлена в таблице 4, таблице 5 и на рисунке 9.

Бинарная логистическая регрессия метастазирования в лимфатические узлы при НМРЛ

В соответствии с результатами корреляционного анализа, экспрессия YTHDC2 была значимо связана с метастазированием в лимфатические узлы (p < 0.05). Для пациентов с НРРЛ был проведен бинарный логистический регрессионный анализ, где зависимой переменной выступало метастазирование в лимфатические узлы, а независимыми переменными — возраст, пол, анамнез курения, стадия опухоли, патологический тип, уровень экспрессии YTHDC2 и степень дифференцировки. Результаты показали, что экспрессия YTHDC2 у пациентов с НРРЛ была значимо связана с метастазированием в лимфатические узлы (p = 0.027, OR = 2.286, 95% CI: 1.101–4.748).

В общих клинических данных стадия опухоли у пациентов с НМРЛ статистически значимо коррелировала с метастазами в лимфатические узлы (p = 0.007, OR = 27, 95% CI: 2.504-291.186). Однако возраст, пол, анамнез курения, патологический тип и степень дифференцировки не имели значимой корреляции с метастазами в лимфатические узлы при НМРЛ (p > 0.05), как показано в Таблице 6.

Доступность данных: Наборы данных, подтверждающие результаты этого исследования, доступны в репозитории Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). Репозиторий включает клинические метаданные TCGA, аннотации образцов, спецификации извлечения данных и манифест анализа, использованные для биоинформационного анализа. Дополнительные данные могут быть предоставлены автором, с которым следует вести переписку, по обоснованному запросу.

Рисунок 1: Блок-схема отбора пациентов и включения тканей для анализа qRT-PCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Схема биоинформатического анализа, проведенного для оценки экспрессии YTHDC2 и ее прогностического значения при NSCLC Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Экспрессия гена YTHDC2 в базе данных TCGA. Уровни экспрессии YTHDC2 при аденокарциноме легкого (LUAD) и плоскоклеточном раке легкого (LUSC) сравнивали с уровнями в нормальных тканях легкого, используя данные секвенирования РНК, полученные из Атласа генома рака (TCGA) через портал данных Genomic Data Commons (GDC), и анализировали с помощью веб-платформы GEPIA. Данные анализировали на платформе GEPIA. Статистическая значимость определялась при значении p < 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Дифференциальная экспрессия YTHDC2 при НМРЛ по результатам анализа базы данных GEPIA. Уровни экспрессии YTHDC2 при аденокарциноме легкого (LUAD) и плоскоклеточном раке легкого (LUSC) сравнивали с уровнями в нормальных тканях легкого, используя данные проектов The Cancer Genome Atlas (TCGA) и Genotype-Tissue Expression (GTEx) через платформу GEPIA. Диаграммы размаха представляют нормализованные уровни экспрессии генов. Статистическая значимость определялась при p-value < 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Анализ экспрессии YTHDC2 по стадиям при НМРЛ с использованием базы данных GEPIA. Уровни экспрессии YTHDC2 анализировались для различных патологических стадий (I–IV) НМРЛ с помощью платформы GEPIA. График стадий иллюстрирует вариации экспрессии гена в зависимости от стадии опухоли. Статистически значимых различий в экспрессии YTHDC2 между стадиями не обнаружено (p = 0,644). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Анализ выживаемости Каплана–Мейера в зависимости от экспрессии YTHDC2 у пациентов с НМРЛ (Kaplan–Meier Plotter). (A) Общая выживаемость (OS): кривые выживаемости Каплана–Мейера, сравнивающие общую выживаемость пациентов с НМРЛ, разделенных на группы с высокой (n = 140) и низкой (n = 364) экспрессией YTHDC2, с использованием оптимального значения порога («auto-select best cutoff»), определенного инструментом Kaplan–Meier Plotter. Для оценки статистической значимости использовался лог-ранговый критерий (p = 0.0093); отношение рисков (HR) = 0.61; 95% доверительный интервал (CI): 0.42–0.89. Повышенная экспрессия YTHDC2 ассоциирована со значительно более высокой общей выживаемостью. (B) Выживаемость после прогрессирования (PPS): кривые выживаемости Каплана–Мейера, сравнивающие выживаемость после прогрессирования у пациентов с НМРЛ, разделенных на группы с высокой (n = 181) и низкой (n = 296) экспрессией YTHDC2, с использованием оптимального значения порога («auto-select best cutoff»), определенного инструментом Kaplan–Meier Plotter. Для статистического сравнения использовался лог-ранговый критерий (p = 4.2 × 10⁻⁵); отношение рисков (HR) = 0.63 (95% доверительный интервал: 0.51–0.79). Высокая экспрессия YTHDC2 ассоциирована со значительно более длительной выживаемостью после прогрессирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Модель прогнозирования выживаемости YTHDC2. ROC-кривые (Receiver operating characteristic), оценивающие прогностическую точность YTHDC2 в отношении общей выживаемости пациентов TCGA-LUAD и TCGA-LUSC с доступными данными экспрессии RNA-seq и выживаемости в точках 1, 3, 5 и 8 лет. Значения AUC: 1 год = 0.50, 3 года = 0.51, 5 лет = 0.52 и 8 лет = 0.52. Пунктирная диагональная линия соответствует случайному шансу (AUC = 0.5). Анализ выполнен с использованием пакета survival ROC в R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Экспрессия YTHDC2 в парных образцах опухоли НМРЛ и прилежащих нормальных тканей, измеренная с помощью qRT-PCR. Относительная экспрессия YTHDC2 была рассчитана с использованием метода 2^–ΔCt и нормирована по GAPDH. Значения экспрессии представляют собой нормированные уровни экспрессии, а не кратность изменения относительно калибратора. Статистический анализ был проведен с использованием 19 доступных пар «опухоль — прилежащая нормальная ткань» для парного сравнения. Данные представлены в виде отдельных парных наблюдений со значением среднего ± стандартное отклонение. Различия между парными образцами анализировали с помощью критерия знаковых рангов Уилкоксона (p = 0.537). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Связь между экспрессией YTHDC2 и клинико-патологическими характеристиками у пациентов с НМРЛ. (A) Экспрессия YTHDC2 при различных патологических типах, демонстрирующая более высокую экспрессию при плоскоклеточном раке, чем при аденокарциноме (p < 0.05). (B) Экспрессия YTHDC2 в зависимости от статуса метастазирования в лимфатические узлы, демонстрирующая более высокую экспрессию у пациентов с метастазами в лимфоузлы, чем у пациентов без метастазов (p < 0.05). (C) Экспрессия YTHDC2 при различных степенях гистологической дифференцировки, без статистически значимых различий (p = 0.181). (D) Экспрессия YTHDC2 на разных клинических стадиях по классификации CSCO, без статистически значимых различий (p = 0.08). Уровни экспрессии YTHDC2 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и рассчитывали с использованием метода 2^–ΔCt с нормализацией по GAPDH. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистические сравнения проводили с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона. *p < 0.05 считалось статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

№	Критерии включения	Критерии исключения
1	Возраст ≥18 лет, независимо от пола.	Диагноз других злокачественных новообразований.
2	Подтвержденный диагноз НМРЛ в соответствии с Клиническими рекомендациями Китайской медицинской ассоциации по раку легкого (издание 2024 г.).	Наличие хронических респираторных или сердечно-сосудистых заболеваний (например, ХОБЛ, легочное сердце, сердечная недостаточность).
3	Наличие полных клинических данных, включая демографические сведения, сывороточные онкомаркеры и результаты КТ грудной клетки с контрастированием, при наличии подписанного информированного согласия.	Тяжелая органная недостаточность, включая почечную недостаточность (eGFR <30 ml/min/1.73m²) или цирроз печени.
4	Пациенты, ранее не получавшие лечения (treatment-naive), без предшествующей противоопухолевой терапии.	Особые группы населения, включая беременных или кормящих женщин (подтверждается тестом на β-hCG, где применимо).
5	Наличие достаточного количества образцов опухоли и/или прилежащей ткани, пригодных для молекулярного анализа.	Неудовлетворительное качество образцов, включая недостаточный объем ткани или деградированную RNA (подтверждается заключением патоморфолога).

Таблица 1: Критерии включения и исключения пациентов с НМРЛ в исследование

Тип ткани	Количество анализируемых парных образцов (n)	Относительная экспрессия (Среднее ± SD)
Опухолевая ткань	19	3.24 ± 2.34
Соответствующая прилегающая нормальная ткань	19	3.60 ± 1.70

Таблица 2: Экспрессия YTHDC2 в парных образцах опухоли НМРЛ и прилегающей нормальной ткани. Относительная экспрессия YTHDC2 измерялась методом 2^–ΔCt и была нормализована по GAPDH. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистическое сравнение 19 пар соответствующих образцов опухоли и прилегающей нормальной ткани проводилось с использованием критерия знаковых рангов Уилкоксона (p = 0,537).

Целевой ген	Праймер/Зонд	Последовательность (5′→3′)
YTHDC2	Прямой (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Обратный (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Зонд (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Прямой (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Обратный (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Зонд (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Таблица 3: Последовательности праймеров и зондов, использованных для количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР).Экспрессия YTHDC2 определялась с помощью технологии TaqMan, при этом GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля.

Характеристика	Категория	n	%
Патологический тип	Аденокарцинома	41	82
	Плоскоклеточный рак	9	18
Стадирование по CSCO	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Метастазы в лимфоузлы	Нет	24	48
	Да	26	52
Степень дифференцировки	Низкая дифференцировка	9	18
	Умеренная/высокая дифференцировка	41	82
Возраст	≥60 лет	36	72
	<60 лет	14	28
Пол	Мужской	32	64
	Женский	18	36
Курение в анамнезе	Да	25	50
	Нет	25	50

Таблица 4: Клинические и патологические характеристики пациентов с НМРЛ. Данные представлены в виде чисел (n) и процентов (%) относительно общей исследуемой популяции (n = 50).

Клинико-патологическая характеристика	Группа	н	Экспрессия YTHDC2 (среднее значение ± СО)	pp-значение
Тип ткани	Опухоль	30	3.24 ± 2.34	0.537
	Прилегающая нормальная ткань	19	3.60 ± 1.70
Патоморфологический тип	Аденокарцинома	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	Плоскоклеточный рак	4	7.50 ± 3.41
Стадирование по CSCO	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
Метастазы в лимфатические узлы	Нет	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	Да	11	5.70 ± 2.53
Гистологическая дифференцировка	Умеренно-высокодифференцированный	25	4.33 ± 1.90	0.181
	Низкодифференцированный	5	5.18 ± 1.60
Возраст	≥60 лет	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 лет	10	4.16 ± 1.12
Анамнез курения	Да	12	4.62 ± 2.40	0.845
	Нет	18	4.38 ± 1.40

Таблица 5: Связь между экспрессией YTHDC2 и клинико-патологическими характеристиками у пациентов с НМРЛ. Экспрессия YTHDC2 была измерена с помощью qRT-PCR и рассчитана методом 2^–ΔCt с нормализацией по GAPDH. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Размер групп (n) соответствует количеству проанализированных валидных образцов. Статистические сравнения между группами проводились с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. *p < 0,05 считалось статистически значимым.

Переменная	β	Wald	p-значение	OR	95% ДИ
Возраст (≥60 против <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Пол (женский против мужского)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Курение в анамнезе (да против нет)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Стадия опухоли (III–IV против I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Дифференцировка (низкая против умеренной/высокой)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
Экспрессия YTHDC2	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Таблица 6: Многофакторный логистический регрессионный анализ факторов, связанных с метастазированием в лимфатические узлы у пациентов с НМРЛ. Бинарная логистическая регрессия была проведена с использованием метастазирования в лимфатические узлы в качестве зависимой переменной. Приведены отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI). Контрольные категории: возраст (<60 лет), пол (мужской), анамнез курения (нет), стадия опухоли (I–II) и дифференцировка (умеренная–высокая). *p < 0.05 указывает на статистическую значимость.

Обсуждение

YTHDC2, самый крупный белок семейства YTH, связывающий N6-метиладенозин (m6A), уникален своей АТФ-зависимой РНК-хеликазной активностью, что делает его ключевым регулятором метаболизма РНК¹³. В отличие от других членов семейства YTH, YTHDC2 обнаруживается как в ядре, так и в цитоплазме, где он регулирует трансляцию мРНК и стабильность РНК¹⁴. Предыдущие экспериментальные исследования показали, что YTHDC2 подавляет прогрессирование аденокарциномы легкого (LUAD), ингибируя экспрессию мРНК ADIRF и MRPL12, усиливая апоптоз, а также снижая пролиферацию и метастазирование клеток^15,16. Ранее также было показано, что YTHDC2 стабилизирует такие lncRNA, как ZNRD1-AS1, для подавления пролиферации LUAD, и модулирует m6A-модифицированные мРНК, такие как CYLD и SLC7A11, ингибируя сигнальный путь NF-κB, захват цистеина и антиоксидантные процессы, одновременно стимулируя ферроптоз и противоопухолевую активность^17,18.

В данном исследовании экспрессия и клиническая значимость белка-считывателя m6A YTHDC2 при НМРЛ были изучены с использованием интегративного подхода, сочетающего биоинформатический анализ и экспериментальную валидацию. Биоинформатический анализ баз данных TCGA и GEPIA выявил значительное снижение экспрессии YTHDC2 в опухолевых тканях НМРЛ по сравнению с нормальными тканями легкого; при этом более высокая экспрессия YTHDC2 была связана с улучшением общей и постпрогрессионной выживаемости, что указывает на потенциальную прогностическую роль. Интересно, что наши эксперименты с помощью qRT-PCR с использованием 19 доступных парных образцов опухоли и прилежащей нормальной ткани в данной когорте не выявили статистически значимой разницы в экспрессии YTHDC2 между опухолевой и прилежащей нормальной тканями. Это несоответствие подчеркивает сложности переноса результатов из крупномасштабных открытых наборов данных на независимые клинические когорты и указывает на необходимость осторожной интерпретации анализов in silico. Понимание причин этих различий имеет решающее значение для точной оценки полезности YTHDC2 в качестве биомаркера и терапевтической мишени при НМРЛ. Внимание настоящего исследования к YTHDC2 обусловлено его уникальной хеликазной активностью среди считывателей YTH¹⁹, однако недавние панраковые анализы выявляют контекстно-зависимые роли других членов этого семейства. Например, Li и соавт. продемонстрировали, что YTHDF1/2 повышены в большинстве видов рака (например, LIHC, LUAD) и коррелируют с плохим прогнозом, в то время как YTHDC1/2 проявляют опухолесупрессорные эффекты при KIRC и BRCA²⁰. Примечательно, что онкогенная роль YTHDF1 через активацию Wnt/β-catenin контрастирует с антиметастатической функцией YTHDC2 при НМРЛ, что подчеркивает необходимость стратегий использования биомаркеров, специфичных для конкретного подтипа. По сравнению с установленными прогностическими маркерами (например, PD-L1 для ответа на иммунотерапию), прогностическая ценность YTHDC2 может быть усилена путем его сочетания с другими регуляторами m6A (например, METTL3, YTHDF1) или генами иммунных контрольных точек, как предполагают панраковые анализы иммунной инфильтрации. Хотя предыдущие исследования позволяют предположить, что YTHDC2 регулирует путь NF-κB/CYLD¹², настоящее исследование было ограничено отсутствием валидации на уровне белка с помощью иммуногистохимии или вестерн-блоттинга, а также отсутствием функциональной валидации. Будущие работы должны сочетать анализ нокдауна с m6A-секвенированием для картирования прямых мишеней.

Предыдущие анализы показали, что экспрессия YTHDC2 снижена в тканях НМРЛ и коррелирует с плохим прогнозом²¹. Анализ Каплана-Мейера указал на более длительную выживаемость у пациентов с более высокой экспрессией YTHDC2, однако анализ ROC-кривых свидетельствует об ограниченной прогностической значимости в отношении выживаемости²⁰. ROC-анализ выживаемости в настоящем исследовании проводился с использованием данных экспрессии RNA-seq и данных о выживаемости из TCGA, так как информация о долгосрочном наблюдении за нашей локальной клинической когортой отсутствовала. Важно отметить, что низкие значения AUC (~0.5), наблюдаемые в данном исследовании, указывают на то, что экспрессия YTHDC2 не обладает достаточной чувствительностью и специфичностью для клинического использования в качестве самостоятельного биомаркера²². Это ограничение согласуется с появляющимися данными о том, что одногенных биомаркеров часто недостаточно для таких сложных заболеваний, как НМРЛ, где для достижения клинически значимой прогностической эффективности все чаще требуются мультиомиксные подходы и интегрированные панели биомаркеров. Более высокая экспрессия YTHDC2 наблюдалась в тканях НМРЛ с метастазами в лимфатические узлы, что предполагает потенциальную связь между экспрессией YTHDC2 и статусом метастазирования в лимфоузлы в данной когорте. Хотя различия в экспрессии YTHDC2 также наблюдались между аденокарциномой и плоскоклеточным раком, эту сравнительную характеристику следует интерпретировать с осторожностью, так как для анализа было доступно всего 4 образцов плоскоклеточного рака, что существенно ограничивает статистическую мощность сравнения в этой подгруппе. Значимых различий по клинической стадии, дифференцировке, возрасту или анамнезу курения обнаружено не было, что, вероятно, связано с ограничениями исследования, включая размер выборки и одноцентровой дизайн. Несмотря на то, что наблюдаемая связь между снижением экспрессии YTHDC2 и метастазами в лимфатические узлы указывает на потенциальную биологическую роль в НМРЛ, низкая дискриминационная способность (AUC ~0.5) и противоречивые результаты детекции методом qRT-PCR исключают его использование в качестве самостоятельного клинического маркера. В будущих исследованиях следует изучить, улучшает ли сочетание YTHDC2 с другими m6A-связанными белками прогностическую ценность.

Биоинформатический анализ показал, что экспрессия YTHDC2 снижена при НМРЛ и может быть связана с более благоприятными исходами для пациентов. Хотя снижение экспрессии также наблюдалось у пациентов с метастазами в лимфатические узлы и были отмечены различия между патологическими подтипами, результаты по этим подгруппам следует интерпретировать с осторожностью из-за ограниченного размера выборки, особенно для плоскоклеточного рака. Однако эти данные не были подтверждены анализом qRT-PCR в нашей клинической когорте, что может быть обусловлено различиями в характеристиках когорт, размере выборки, технической вариабельностью, посттранскрипционной регуляцией или отсутствием валидации на уровне белка. Будущие исследования должны быть направлены на изучение механизмов действия YTHDC2 при других подтипах рака легкого с помощью экспериментов in vitro и in vivo. Такие исследования могут дополнительно прояснить биологическую роль YTHDC2 и определить, обладает ли этот белок клинической значимостью в рамках мультимаркерного подхода, а не в качестве самостоятельного биомаркера.

Ограничения

Данное исследование имеет несколько ограничений. Оно представляло собой одноцентровое ретроспективное исследование с относительно небольшим объемом выборки, что может ограничивать обобщаемость результатов. Использование тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE), могло повлиять на качество РНК и чувствительность qRT-PCR. Кроме того, оценивалась только экспрессия мРНК YTHDC2, и валидация на уровне белка с помощью иммуногистохимии (ИГХ) или вестерн-блоттинга не проводилась. Поскольку экспрессия мРНК не обязательно коррелирует с количеством белка из-за посттранскрипционной регуляции, это может частично объяснить расхождение между нашими клиническими данными и результатами анализа общедоступных баз данных. В исследовании также отсутствовали данные долгосрочного наблюдения, а анализы в подгруппах (например, плоскоклеточный рак) имели недостаточную статистическую мощность.

Перспективы дальнейших исследований

Будущие исследования должны быть направлены на изучение механизмов действия YTHDC2 при NSCLC с помощью экспериментов in vitro и in vivo для более глубокого понимания его функциональной роли. Для подтверждения полученных результатов и повышения их обобщаемости необходимы многоцентровые исследования с большим объемом выборки. Кроме того, интеграция YTHDC2 с другими регуляторами m6A и клиникопатологическими переменными может повысить его прогностическую и предиктивную ценность. Для выяснения биологических механизмов, лежащих в основе дисрегуляции YTHDC2, необходимы дальнейшие исследования с применением мультиомиксных подходов, включая транскриптомику, протеомику и эпигеномику. Также следует провести валидацию на белковом уровне с помощью иммуногистохимии (IHC) или вестерн-блоттинга для оценки соответствия экспрессии мРНК и белка. Стандартизация обработки образцов и методов валидации также будет иметь решающее значение для обеспечения воспроизводимости и клинической применимости.

Заключение

В данном исследовании представлена предварительная оценка экспрессии YTHDC2 при НМРЛ путем объединения биоинформатического анализа с клинической валидацией с помощью qRT-PCR. Однако противоречивые результаты детекции на различных аналитических платформах и ограниченная диагностическая точность (AUC ≈0.5) в настоящее время исключают возможность использования данного маркера в качестве самостоятельного клинического биомаркера. Хотя биоинформатический анализ указывает на потенциальную прогностическую значимость, независимая клиническая валидация не подтверждает его надежность для диагностического или прогностического применения. Эти результаты следует интерпретировать с осторожностью; перед рассмотрением любого клинического применения необходима валидация в более крупных многоцентровых когортах, а также проведение исследований на уровне белков и функциональных исследований.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Специфические праймеры и зонды	Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай	Синтез на заказ	Последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 6
ДНКаза I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай	ДНКаза I (HiPure FFPE RNA Kit)	Удаление контаминации геномной ДНК
Алгоритм ESTIMATE	Yoshihara et al.	Пакет R (версия 1.0.13)	Оценка чистоты опухоли
Набор для экстракции РНК из FFPE-образцов	Magen Biotechnology Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	Экстракция РНК из FFPE-тканей
Портал данных GDC	Национальный институт рака (NCI), NIH, США	https://portal.gdc.cancer.gov	Загрузка наборов данных TCGA
Веб-сервер GEPIA	Пекинский университет, Китай	http://gepia.cancer-pku.cn	Анализ экспрессии генов
Kaplan–Meier Plotter	Университет Земмельвейса, Венгрия	https://kmplot.com	Анализ выживаемости
Микроцентрифуга	Eppendorf AG, Гамбург, Германия	5424 R	Процедуры очистки РНК
Спектрофотометр NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	NanoDrop 2000/2000c	Количественное определение РНК
Мастер-микс для qPCR с зондами	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Количественная ПЦР-амплификация
Статистическое ПО R	R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия	Версия 4.4.1	Статистический анализ и ROC-анализ
Система ПЦР в реальном времени	Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США	CFX Opus 96	Количественная ПЦР в реальном времени
Набор для обратной транскрипции	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	Синтез кДНК
Колонка для очистки РНК	Magen Biotechnology Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай	HiPure Mini Column I	Колонка для очистки РНК на силикатной мембране
Вода, свободная от РНказ	Magen Biotechnology Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай	RNase-Free Water	Элюция РНК
SPSS Statistics	IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США	IBM SPSS Statistics версия 27.0	Статистический анализ
Пакет survivalROC	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Версия 1.0.3.1	Зависимый от времени ROC-анализ
База данных TCGA	Национальный институт рака (NCI), NIH, США	https://portal.gdc.cancer.gov	Публичная база данных геномики рака
Промывочный буфер RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай	Буфер RW1	Промывочный буфер для очистки РНК
Промывочный буфер RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай	Буфер RW2	Промывочный буфер для очистки РНК