Методическая статья

Протоколы эффективного разведения и функционального анализа эндопаразитоидной осы Asobara japonica и её хозяина Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/72035

⸱

24 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Degree Programs in Life and Earth Sciences, Graduate School of Science and Technology, University of Tsukuba, 2Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba, 3Doctoral Program in Humanics, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого протокола — облегчить функциональный анализ взаимодействий паразитоидов и хозяина у Asobara japonica и Drosophila melanogaster. с помощью оптимизированных методов выращивания, анализа на инфекцию с одиночным откладением яиц и устранения генов с помощью РНКi.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Паразитизм — это биологическое взаимодействие, при котором один организм эксплуатирует тело или ресурсы другого (хозяина), что приводит к значительному ущербу или смерти хозяина. Среди паразитических животных паразитоидные осы являются одними из самых богатых видами линий, составляющих почти 20% всех видов насекомых. В частности, эндопаразитоидные осы откладывают яйца непосредственно в тела хозяина и используют разнообразные ядовитые факторы для управления развитием хозяина, иммунитетом и физиологией. В ответ на атаку ос хозяева пытаются уничтожить паразитоидные яйца с помощью врождённых иммунных механизмов. Однако молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых отдельные компоненты яда модулируют биологию хозяина и способствуют успешному паразитизму, остаются плохо изученными. Здесь мы описываем стандартизированный лабораторный протокол по разведению эндопаразитоидной осы Asobara japonica и её хозяина Drosophila melanogaster. Доступны как партеногенетические, так и половые штаммы A. japonica, а партеногенетический штамм демонстрирует высокий уровень успеха паразитизма, что позволяет стабильно поддерживать лабораторные запасы для анализа генома и тестов паразитизма. Для функционального анализа генов яда были оптимизированы анализ на инфекции с помощью яидесятых яиц и двухцепочечный метод устранения генов на основе РНК. Вместе эти протоколы предоставляют практическую экспериментальную основу для анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействий паразитоидов и хозяина, и будут способствовать будущим исследованиям в области биологии развития, иммунологии и физиологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Паразитизм — это образ жизни, при котором один организм использует питательные ресурсы другого, и он широко распространён среди таксонов. Считается, что до половины всех известных организмов проявляют паразитизм в течениежизненного цикла 1. Среди паразитов паразитоидные осы — особенно разнообразная группа, составляющая примерно 20% всехнасекомых. Они эксплуатируют широкий спектр членистоногих хозяев, таких как насекомые, пауки и клещи, и демонстрируют удивительное разнообразие в своей жизненной истории и паразитическихстратегиях 3. Эти особенности делают паразитоидных ос одной из самых эволюционно и экологически успешных групп насекомых.

Взаимодействия между паразитоидами и их хозяевами были широко изучены как модельные системы эволюционных «гонок вооружений». В частности, эндопаразитоидные осы используют широкий спектр факторов, включая яды, симбиотические вирусы итератоциты 4,5. Эти факторы влияют на физиологию и развитие хозяина, обеспечивая успешное развитие внутри хозяина. Несмотря на эти достижения, молекулярные механизмы, лежащие в основе паразитизма, остаются плохо изученными у большинства паразитоидных видов. Одним из серьёзных ограничений является их небольшой размер тела, что затрудняет биохимическую идентификацию компонентов яда. Кроме того, технически сложно поддерживать паразитоидов и их хозяев с синхронизированными стадиями развития в лабораторных условиях.

Недавние достижения в секвенировании следующего поколения и других омикс-технологиях теперь позволяют проводить анализ на уровне всего генома даже у очень мелких паразитоидных видов. Эти подходы открыли новые возможности для изучения ранее недоступных молекулярных механизмов, позволив изучать взаимодействия паразитоидов и хозяина с беспрецедентным разрешением. В этом контексте наша лаборатория сосредоточена на Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), виде, впервые выявленном вЯпонии 6,7,8. A. japonica включает телитокозный партеногенетический штамм, при котором самки производят потомство без спаривания. Эта особенность позволяет нам собирать значительные объёмы генетически однородной геномной ДНК для секвенирования целогогенома 9. Кроме того, этот вид паразитирует на широком спектре видов рода Drosophila, включая модельный организм D. melanogaster,  который предлагает значительные экспериментальные преимущества благодаря хорошо устоявшимся условиям выращивания и точно определённым стадиям развития, позволяя проводить воспроизводимые анализы инфекций и точно контролировать развитие паразитоидов10.

Во время паразитизма A. japonica самка осы вводит яд вместе с одним яйцом личинке мухи, внутри которой вместе с хозяином растёт личинка осы. Примечательно, что у A. japonica высокий уровень успешного паразитизма на хозяине D. melanogaster, что делает эту пару паразитоид-хозяин мощной экспериментальной моделью. Здесь мы описываем протоколы стабильного выращивания, анализ на инфекцию с одной яйцекладкой и метод устранения генов на основе двухцепочечной РНК (dsRNA) у A. japonica. Эти протоколы предоставляют надёжную основу для анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействий паразитоидов и хозяина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематический обзор синхронизированного метода выращивания D. melanogaster и A. japonica представлен на рисунке 1.

1. Выращивание плодовой мушки-хозяина Drosophila melanogaster в лаборатории

  1. Поддерживайте всех экспериментальных животных при 25 °C и относительной влажности 50-60% в цикле 12:12 часа. Используйте дикий штамм Oregon-R (OR) в качестве хозяина для A. japonica (рисунок 2A).
  2. Переместить взрослых мух в новый кормовой флакон со стандартной кукурузной мукой-дрожжевой агаровой средой (0,55% агар, таблица 1). Маркируйте флакон датой передачи и названием сорта «OR».
  3. Очистите этих взрослых мух на следующий день после переноса, чтобы предотвратить чрезмерное количество яиц в корме. Убедитесь, что личинки потомства питаются на поверхности корма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве рекомендации поддерживайте примерно 200-250 яиц в каждом флаконе (φ30×100 мм). Более высокая плотность яиц может снижать успех паразитизма и увеличивать разнообразие в развитии хозяина и ос.
  4. Через четыре дня после шага 1.2 переложите ложку личинок мух (через 4 дня после откладки яиц, dAEL) в новый флакон для корма. Держать этих личинок вне контакта с паразитоидами для следующего поколения. Эта процедура также помогает контролировать плотность личинок хозяина в флаконе.

2. Разведение эндопаразитоидной осы Asobara japonica в лаборатории

  1. Используйте партеногенетический штамм Tokyo (TK) и половой штамм Iriomote-jima (IR) (рисунок 2B). Первая состоит из самок, а вторая — из самок и самцов. Самцы закрываются на два-четыре дня раньше самок. Поэтому подтверждайте наличие самок у их яйцекладов до переноса.
  2. Пересадите 10-20 взрослых ос непосредственно из флакона в флакон с личинками мух при 4 dAEL. Маркируйте флакон датой передачи и названием сорта «TK» или «IR». Поддерживайте ос в тех же условиях, что и шаг 1.1.
  3. Позвольте взрослым осам откладывать яйца в личинках мух. Очищайте этих ос через один-два дня, чтобы предотвратить суперпаразитизм, который может привести к гибели хозяина. Удалять закрытых взрослых мух, сбежавших от паразитизма, через 10 и более дней после Шага 2.2.
  4. Через две недели после шага 2.2 взрослые осы начинают замыкаться из куколки мухи-хозяина. Перенесите этих недавно закрытых взрослых ос в новый кормовой флакон с фильтрующей бумагой, содержащей 25% глюкозы и 50 мМ раствора витамина C. Кусочки фильтрующей бумаги следует стерилизовать при 130 °C в течение 2 часа. Размещение раствора на фильтровой бумаге способствует откладению яиц и продлевает продолжительность жизни взрослых ос. Наш подход к использованию витамина C для улучшения откладки яиц был вдохновлён наблюдениями в исследованиях Drosophila 11.

3. Однояйцевый анализ инфекций

  1. Синхронизировать стадию развития личинок мух, используемых для эксперимента с инфекцией.
    1. Поместите взрослых мух в трубку объёмом 50 мл с тарелкой для агар-пластины с виноградным соком (3% агар), намазанной свежей дрожжевой пастой, и дайте им откладывать яйца в течение 24 часов.
    2. Соберите только что вылупившиеся личинки первого возраста на тарелке с виноградным соком агаром и переместите их в небольшой флакон (12 мл), содержащий 2-3 г паста для мух (корм для мух, смешанный с соответствующим количеством воды). В флакон помещают 20–30 личинок. Личинкам мух разрешают расти при температуре 25 °C.
  2. В подходящее время приготовьте чашку Петри диаметром 4 см, содержащую тонкий, равномерно распределённый слой пасты для корма для мух, покрывающий площадь диаметром примерно 1,5–2,0 см (далее — арена для анализа инфекции). Помимо теста инфекций, подготовьте новый небольшой флакон (12 мл) с соответствующим количеством пасты для корма для мух. Этот флакон используется для выращивания личинок хозяина после анализа инфекции.
  3. Соберите поэтапные личинки и переместите их в тарелку с деионизированной водой (сопротивление = 15 МОм·см, 25 °C). Промывайте личинок в блюде с помощью аккуратного перемешивания, чтобы удалить остатки пищи из их организма.
  4. После промывания аккуратно удаляйте лишнюю влагу с личинок с помощью бумажных салфеток без ворса, так как избыточная вода мешает откладке яиц ос на арене анализа инфекции. Затем перенесите личинок на арену. Этот этап увеличивает активность личинок во время эксперимента с инфекцией.
  5. Анестезия взрослых ос газомCO2 при расходе 5 л·мин-1 и давлении 0,2 МПа. Затем аккуратно поместите примерно три самки ос в зону для анализа инфекции. Закройте крышку блюда и дайте им восстановиться на пасте для корма для мух.
  6. Наблюдайте поведение откладки яиц этих ос под стереомикроскопом (режим увеличения: 10× 15×).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда оса касается тела движущейся личинки мухи, она быстро вводит яйцеклад в тело мухи и вводит компоненты яда. Хотя личинка мухи извивается и дергается телом, она сразу же парализована. Впоследствии оса вибрирует брюшко и откладывает яйцо в тело личинки хозяина, после чего яйцеклад удаляется. Это поведение при откладении яиц называется инфекцией.
  7. После заражения откройте крышку и перенесите личинку инфицированной мухи в новый небольшой флакон с пастой для корма мух, приготовленной в шаге 3.2. Для стандартизации времени заражения проводите эксперимент с инфекцией в течение 15 минут.
  8. Маркируйте небольшой флакон экспериментальной информацией, такой как дата, название образца, время заражения и количество особей. Эти флаконы заглушают и помещают в влажный контейнер, где хранят при температуре 25 °C.

4. Генерация ос с интерференцией РНК (РНКи) путём инъекции dsRNA

  1. Синтезируйте dsRNA диаметром 400 bp или более для устранения генов (интерференция РНК, RNAi) с помощью системы синтеза dsRNA на основе транскрипции in vitro . Образцы дсРНК следует поддерживать при -20–-80 °C до применения. Подробные протоколы, как описаноранее, 9.
  2. Приготовьте чашку Петри диаметром 5,5 см с 2% агар для размещения тел ос. Наполните две трети каждой порции агаром, чтобы получить толстый слой тарелки для инъекции.
  3. Положите на крышку пластиковой тарелки бумажную салфетку без ворса, смоченной водой.
  4. Соберите куколки мух-хозяина через 7 дней после заражения (dpi) из флакона и положите их на бумажные салфетки без ворса, подготовленные в шаге 4.3. Добавление капли воды в стенку флакона помогает отделить куколки мух хозяина от флакона.
  5. Под стереомикроскопом (режим увеличения: 20×) удалите куколку мухи хозяина и обнажите тело осы щипцем. При 7 dpi большинство ос находятся на стадии куколки, где различимы голова, грудная клетка и брюшко. Тело осы неподвижно.
  6. Поместите найденные тела ос на агарную пластину, подготовленную в шаге 4.2, выровняя их оси тела в той же ориентации. Расположите 20-30 тел ос с их спинной стороной вверх в одну-две линии. Удалите лишнюю влагу с агарной пластины с помощью безворсовой бумажной салфетки, чтобы осы не скользили.
  7. Следуя инструкциям производителя, установите инжекторный аппарат и стереомикроскоп (рисунок 3A). Используйте систему микроинъекции с стеклянной капиллярной иглой, которая позволяет точно контролировать объём и скорость инъекции. Поместите агарную пластину, в которой головки ос ориентированы к кончику иглы для инъекции. Объём впрыска составляет 50 нл·wasp-1 , а скорость впрыска — 50 нл·сек-1 на форсунке.
  8. Подготовьте стеклянные капиллярные иглы с помощью игла. Форма стеклянного капилляра регулируется в зависимости от температуры нагревателя.
  9. Положите иглу стеклянного капилляра на шлифовальную машину под углом 30-35°. Шлифуйте иглой, пока длина кончика не достигнет 0,04 мм (четыре раздела на сетке окуляра, рисунок 3B).
  10. Непосредственно перед инъекцией разморозьте дсРНК. Концентрация дсРНК составляет 0,25-1 мкг·μл-1. Для визуализации раствор дсРНК окрашивают синим красителем (соль эриоглауцина динатрия, 2% веса·объём-1). С помощью наконечника пипетки микрозагрузчика заполните стеклянный капилляр раствором dsRNA синим красителем. 4 мкл достаточно для инъекции 30 тел ос. Убедитесь, что внутри раствора нет пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После загрузки раствора dsRNA аккуратно постучите ногтем по боковой стороне иглы, чтобы удалить застрявшие пузырьки воздуха. Остаточные пузырьки воздуха могут препятствовать потоку раствора и мешать успешному введению.
  11. Используя шприц объёмом 1 мл и иглу, заполните свободную часть стеклянного капилляра минеральным маслом, чтобы внутри капилляра не осталось пузырьков воздуха.
  12. Прикрепите стеклянную капиллярную иглу с раствором dsRNA и минеральным маслом к держателю иглы и закрепите её на инъекционном устройстве.
  13. Отрегулировать положение агарной пластины и стеклянной капиллярной иглы на инжекторе так, чтобы стеклянная игла располагалась под углом 30-45° относительно тела ос (рисунок 3A).
  14. Введите стеклянную капиллярную иглу в спинную сторону тела осы, с немного латеральной стороны к спинной средней линии. Микроинъекция раствора дсРНК внутрь организма. Введённый раствор дсРНК виден с помощью синего красителя  (рисунок 3C).
  15. После инъекции поместите агарные пластины в влажный контейнер (относительная влажность 70-80%) и храните их в инкубаторе при температуре 25 °C в течение недели, пока взрослые осы не закроются. Тела повреждённых ос следует извлекать из агарной пластины, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
    ТОЧКА ПАУЗЫ: В шаге 4.6 куколки осы можно держать на агарной пластине несколько часов перед инъекцией. Иглы можно подготовить заранее (шаги 4.8 и 4.9); однако со временем они склонны к засорванию. Свежеприготовленные иглы обычно обеспечивают более надёжную эффективность инъекций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Асексуальные и половые штамы Asobara japonica
A. japonica широко распространён по всей Японии. На основных островах преобладают телитокозные партеногенетические штаммы, тогда как арренотокные половые штаммы встречаются на субтропических островах, включая острова Амами-Осима и Ириомоте-дзима 8,12. В половых штаммах самцы появляются на несколько дней раньше самок, поэтому время переноса взросл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы создали универсальную экспериментальную платформу для изучения взаимодействий паразитоидов и хозяина на молекулярном уровне. Оптимизируя условия выращивания, анализ инфекции с одной яйцекладкой и протокол РНКи, мы обеспечиваем надёжную систему для функциональных исследований факторов, производящихся от паразитоидов. Эта платформа будет способствовать будущим исследованиям, направленным на выявление механизмов, с помощью которых паразитоидные осы манипулируют развит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У нас нет конфликта интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Канате Тачибане, Сион Кудо, Тошия Макино, Шунта Ёримото, Шудзи Сигэнобу, Акико Кавамуре, Ари Фудзиноки и Масако Ииде за техническую помощь. Мы также благодарим всех остальных членов нашей лаборатории.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
50 мл пробиркаGreiner Bio-One210261Инфекционный анализ
1 мл шприцTERUMOSS-01Tинъекция дсРНК
АгарDaisin, Ltd.P-700Разведение
Аснол Петри чаша φ40×13.5ммAs One Corporation1-8549-01Инфекционный анализ
Аснол Петри чаша φ55×17ммAs One Corporation1-8549-02инъекция дсРНК
Голубая краска (Эриоглаукина динатриевая соль)Sigma-Aldrich Co. Llc.861146-25Gинъекция дсРНК
Бутил-р-гидроксибензоатNacalai Tesque, Inc.06327-15Разведение
Регулятор давления СО2YAMATOSANGYOYR-507F-2Инфекционный анализ
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM700Анализ изображений
Кукурузная мукаSunny Maize Co., Ltd.No.4MРазведение
DAPIThermo Fisher Scientific Inc.PI62247Окраска ядер, 1:10000
Деионизированная водаMillipore Inc.ZLXEV030WWИнфекционный анализ
Тянущий стеклянный микропипетка двухстадийныйNarishigePC-10инъекция дсРНК
FijiНДhttps://fiji.scАнализ изображений
Фильтровальная бумагаAdvantecITEM 526Разведение
Флакон для корма для мухChiyoda Science Co., Ltd.KFB-3MРазведение
Пробка для флакона с кормом для мухChiyoda Science Co., Ltd.AS-275Разведение
ПинцетDumont Biologie11252-20Диссекция
Морозильник, -20 °CNihon FreezerGS-3120HCХранение образцов
Морозильник, -80 °CNihon FreezerCLN-52UD2Хранение образцов
Стеклянные предметные стеклаMatsunami Glass Ind., LtdS7213Инфекционный анализ
ГлюкозаShowa Sangyo Co., Ltd.НедоступноРазведение
KOD Plus NeoToyoboKOD-401Синтез дсРНК
ИнкубаторPanasonicMIR-254-PJРазведение
Ligation high Ver.2ToyoboLGK-201Синтез дсРНК
Микромел ручной мельницаNarishigeEG-401инъекция дсРНК
Минеральное маслоNacalai Tesque, Inc.23306-84инъекция дсРНК
Nanoject IIIDrummond Scientific Company3-000-207инъекция дсРНК
Стеклянные капилляры для NanojectDrummond Scientific Company3-000-203-G/Xинъекция дсРНК
pBluescript KS (+) плазмидаНедоступноНедоступноСинтез дсРНК
pBluescript SK (-) плазмидаНедоступноНедоступноСинтез дсРНК
PrimeScript обратная транскриптазаTakara2680AСинтез дсРНК
Пропионовая кислотаNacalai Tesque, Inc.29018-55Разведение
PROWIPEDaio Paper Corporation2-2624-02Инфекционный анализ, инъекция дсРНК.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix с удалением гДНКToyoboFSQ-301qRT-PCR
Реагент RNAiso PlusTakara9108qRT-PCR
Маленький флакон (пробирка 12 мл)SarstedtREF 58.487Инфекционный анализ
Пробка маленького флаконаChiyoda Science Co., ltd.QD-S4Инфекционный анализ
ЛопаточкаAs One Corporation6-522-02Разведение
Квадратная петри чашаEiken Chemical Co., Ltd.64-2192-55, AW2000инъекция дсРНК
СтереомикроскопLeica Microsystemslvesta3 (C-Mount)Инфекционный анализ
СтереомикроскопNikon Solutions Co., Ltd.SMZ1000инъекция дсРНК
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700Синтез дсРНК
Термоциклер Dice Real Time SystemTakaraTP815qRT-PCR
Термоциклер GeneAtlasAstelG02Синтез дсРНК, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR MixToyoboQPS-201qRT-PCR
TissueLyser IIQiagenНедоступноqRT-PCR
Витамин C, L-аскорбиновая кислотаNacalai Tesque, Inc.03420-65Разведение
Сок Welch's Grape 100Asahi Soft drinks Co., Ltd.32390Инфекционный анализ
ДрожжиAsahi Group Foods, Ltd.HB-P02Разведение
```

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи