Оптимизированный протокол создания модели стеноза аортального клапана у мышей путем введения проводника

Краткое содержание

В данном протоколе подробно описана оптимизированная модель стеноза аортального клапана у мышей C57BL/6, индуцированного проводником. Специальная платформа для поддержки сосудов, напечатанная на 3D-принтере, обеспечивает точный контроль кровотечения, что позволяет достичь 95% выживаемости через 24 часа (19/20) и 90% общего успеха модели через 4 недели (18/20).

Аннотация

Стеноз аортального клапана (САК) является серьезным сердечно-сосудистым заболеванием, распространенность которого растет в стареющем населении, однако дефицит тканей пораженного клапана существенно ограничивает исследования механизмов заболевания и разработку методов терапии. В данном протоколе создана и оптимизирована воспроизводимая модель САК на мышах путем усовершенствования метода повреждения клапана с помощью проводника по методике Хонды за счет контролируемого купирования кровотечения. Самцам и самкам мышей линии C57BL/6 наносили повреждение аортального клапана с помощью проводника; процедура была улучшена за счет использования специально разработанной 3D-печатной платформы для поддержки сосудов, которая обеспечивает точный контроль кровотечения при введении и извлечении проводника. Показатели исхода включали выживаемость через 24 ч, эхокардиографическую оценку через 4 недели и гистопатологическую валидацию. Оптимизированный протокол обеспечил выживаемость 95% через 24 ч (19 из 20 животных); среди выживших 94,7% (18 из 19) соответствовали заранее определенному критерию гемодинамического успеха через 4 недели, что дает общий показатель успеха модели 90% (18 из 20 животных), подтвержденный эхокардиографией и гистологическим анализом. Эта стандартизированная модель представляет собой надежную, воспроизводимую платформу для изучения механизмов дегенерации клапана и оценки потенциальных терапевтических вмешательств.

Введение

Клапанные заболевания сердца остаются серьезным бременем для системы здравоохранения как в развитых, так и в развивающихся странах, при этом их распространенность растет параллельно со старением населения¹. Хотя транскатетерная имплантация аортального клапана (TAVI) изменила подход к лечению тяжелого аортального стеноза^2,3, клеточные и молекулярные механизмы, вызывающие дегенерацию клапана, до сих пор изучены недостаточно, и не существует одобренной фармакологической терапии для замедления или обращения вспять прогрессирования заболевания^4,5. Основным препятствием в исследовании заболеваний клапанов является ограниченная доступность пораженных тканей для анализа^6,7. Образцы человеческого аортального клапана трудно получить в достаточном количестве, а животные модели, достоверно воспроизводящие патологические изменения клапана, также были крайне редки⁸. Этот пробел стимулировал постоянные усилия по разработке животных моделей, которые воспроизводят гемодинамические и гистологические признаки стеноза аортального клапана (САК).

Традиционные диетические подходы, такие как длительное кормление с высоким содержанием жиров мышей ApoE⁻/⁻, требуют 20–24 недель и характеризуются низким процентом успеха, так как лишь у небольшой части животных развивается выраженный стенотический фенотип^9,10,11,12. Модель повреждения клапана, индуцированная проводником, описанная Honda et al., позволила устранить многие из этих недостатков за счет механического повреждения створок клапана через доступ к сонной артерии¹³. Оригинальная методика включает диссекцию сонной артерии, ретроградное проведение проводника к аортальному клапану, многократное царапанье створок и ротацию проводника, что вызывает быстрые гемодинамические изменения в течение нескольких дней и приводит к формированию стабильного стенотического фенотипа к 4 неделе^13,14,15,16. Благодаря относительной скорости и прямому воздействию метод Honda получил широкое распространение в современных исследованиях клапанов. Однако остается ряд важных пробелов. Полные детали процедуры не были полностью задокументированы в литературе, отсутствует стандартизация между лабораториями, а роль контроля кровотечения — основного определяющего фактора периоперационной заболеваемости в данной модели — никогда не рассматривалась систематически. Эти несоответствия снижают воспроизводимость и ограничивают возможность трансляции результатов в клинику.

Было выдвинуто предположение, что систематическая оптимизация контроля кровотечения может существенно повысить выживаемость в периоперационном периоде и надежность модели. В данном протоколе представлен усовершенствованный и стандартизированный подход, основанный на методе Honda, с внедрением специально разработанной 3D-печатной платформы для поддержки сосудов. Это устройство позволяет регулировать продольное натяжение сонной артерии, обеспечивая полный временный гемостаз во время введения и извлечения проводника без раздавливания сосуда. Благодаря такому подходу оптимизированный протокол обеспечивает 95% выживаемость через 24 ч (19 из 20 животных); среди выживших 94,7% (18 из 19) соответствуют заранее определенному критерию гемодинамического успеха через 4 недели, что дает общий показатель успеха модели 90% (18 из 20 животных). Пошаговая документация процедуры представлена для обеспечения воспроизводимости в различных лабораториях.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры с животными, описанные в данном протоколе, проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Больницы Западного Китая (протокол № 20240311055). В работе использовались самцы мышей C57BL/6 (8–10 недель; примерно 22–25 g) и самки мышей C57BL/6 (8–10 недель; примерно 18–20 g). Все материалы, реагенты, инструменты, программное обеспечение и специализированные устройства, используемые в данном протоколе, включая специализированную платформу для поддержки сосудов, напечатанную на 3D-принтере, перечислены в Таблице материалов.

1. Предоперационная подготовка и хирургический разрез

1. Анестезируйте мышь с помощью изофлурана (3% для индукции, 1,5–2% для поддержания), распыленного в 100% кислороде. Подтвердите достаточную глубину анестезии, убедившись в отсутствии педального рефлекса (сжатие пальца ноги).
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Изофлуран является летучим анестетиком. Используйте его при наличии системы активного удаления паров или в хорошо проветриваемом помещении, используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и соблюдайте правила техники безопасности вашего учреждения.
2. Нанесите офтальмическую мазь на оба глаза. Поместите мышь в положение на спине на терморегулируемую хирургическую платформу, поддерживающую температуру 37 °C.
3. Подготовьте операционное поле, удалив шерсть в передней области шеи с помощью химического крема для депиляции.
4. Продезинфицируйте кожу, проведя три чередующихся цикла обработки повидон-йодом (или хлоргексидином) и 70% спиртом (или теплым стерильным физраствором), завершив процедуру антисептиком.
5. Для проведения превентальной местной анальгезии введите 0,5% лидокаин подкожно вдоль запланированной линии разреза.
6. Затем с помощью микрохирургических ножниц сделайте продольный разрез кожи по срединной линии (приблизительно 1,0–1,5 cm) на передней части шеи, сместив разрез немного вправо относительно средней линии трахеи.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Микрохирургические ножницы, иглы, проводники и другие острые предметы могут стать причиной травмы. Обращайтесь с ними осторожно и утилизируйте использованные острые предметы в специальные контейнеры для утилизации.

2. Изоляция сосуда и наложение швов

1. Под хирургическим стереомикроскопом обнажите правую общую сонную артерию (RCCA), используя тупую диссекцию через вышележащие слои фасции и мышц. Осторожно отделите RCCA от прилежащего блуждающего нерва и окружающей соединительной ткани, стараясь избегать механического раздражения блуждающего нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры поддерживайте слюнные железы и обнаженные ткани во влажном состоянии, орошая их теплым стерильным физиологическим раствором для предотвращения высыхания.
2. Наложите постоянную лигатуру на дистальный конец RCCA с помощью шелковой нити 6-0, завязав надежный узел, который не проскальзывает.
3. Наложите незатянутый скользящий узел из шелковой нити 6-0 вокруг проксимального сегмента RCCA, оставив его ослабленным для последующего использования при введении проводника.

3. Применение платформы и артериотомия

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией стерилизуйте распечатанную на 3D-принтере платформу с помощью газа этиленоксида (EtO) с последующим достаточным проветриванием, а все металлические хирургические инструменты стерилизуйте в автоклаве.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Оксид этилена токсичен, огнеопасен и канцерогенен. Используйте стерилизацию EtO только в специализированных сертифицированных помещениях, обеспечьте надлежащую аэрацию и соблюдайте установленные в учреждении правила утилизации отходов.

1. Осторожно вставьте напечатанную на 3D-принтере платформу для поддержки сосудов под изолированный сегмент правой общей сонной артерии (RCCA), расположив перевернутую V-образную вершину непосредственно под сосудом.
2. Медленно отрегулируйте положение платформы, чтобы увеличить продольное натяжение RCCA, закрепив предварительно наложенные швы в последовательно более высоких боковых выемках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перевернутая V-образная вершина имеет угол 120°, что позволяет ей соответствовать кривизне сосуда, не сдавливая его стенку. Прекратите увеличивать натяжение в тот момент, когда артериальная пульсация перестанет быть визуально заметной. Этот критический визуальный конечный пункт обеспечивает временный гемостаз без избыточного повреждения сосуда.
3. С помощью микрохирургических ножниц выполните небольшую поперечную артериотомию (примерно на половину окружности сосуда) на стабилизированном сегменте RCCA. При правильно установленном натяжении кровотечение должно быть минимальным или отсутствовать.

4. Введение проводника и повреждение клапана

1. Под микроскопическим контролем введите проводник (диаметром 0,014 дюйма / 0,36 мм) в просвет артерии через поперечную артериотомию в ретроградном направлении по направлению к корню аорты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данный калибр является стандартным для опубликованных моделей повреждения проводником и приближен к диаметру просвета правой общей сонной артерии (RCCA) мыши (~0,4–0,5 мм), что обеспечивает соотношение диаметра проводника к сосуду примерно 0,7–0,9.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Проводник может перфорировать сосуды или окружающие ткани. Медленно продвигайте его под визуальным контролем; утилизируйте использованные проводники как острые предметы или загрязненные хирургические отходы.
2. Затяните предварительно наложенный проксимальный скользящий узел вокруг сосуда и проводника для достижения полного гемостаза в месте введения. После закрепления скользящего узла осторожно удалите напечатанную на 3D-принтере платформу из-под сосуда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При возникновении непредвиденного кровотечения во время введения или если диаметр проводника создает чрезмерное трение, временно переместите платформу, чтобы помочь с гемостазом, или слегка ослабьте натяжение платформы, чтобы дать просвету сосуда расшириться перед повторной попыткой введения.
3. Осторожно продвигайте проводник в ретроградном направлении через RCCA, за дугой аорты по направлению к аортальному клапану. Под контролем эхокардиографии в режиме реального времени подтвердите, что кончик проводника пересек аортальный клапан и entered в левый желудочек.
4. При полностью затянутом проксимальном скользящем узле для поддержания гемостаза выполните механическое повреждение клапана, совершив 100 возвратно-поступательных движений проводником через аортальный клапан, после чего выполните 100 вращательных движений проводника по створкам клапана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество в 100 возвратно-поступательных и 100 вращательных движений было установлено в ходе обширной внутренней оптимизации как число, наилучшим образом сочетающее время процедуры с надежным индуцированием гемодинамически значимого стеноза.

5. Извлечение проводника и закрытие раны

1. После завершения повреждения клапана медленно извлеките проводник из сосуда.
2. Сразу же замените проксимальный скользящий узел на постоянный неразвязывающийся узел, чтобы перевязать проксимальную правую общую сонных артерию (RCCA) и предотвратить послеоперационное кровотечение.
3. Закройте разрез кожи прерывистыми швами нейлоновой нитью 5-0 или хирургическими зажимами для ран.
4. Не назначайте послеоперационный прием нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Не вводите периоперационные антибиотики, так как процедура проводится в асептических условиях.
5. Переместите животное в чистую, обогреваемую клетку для восстановления и непрерывно наблюдайте за ним до полного восстановления способности к передвижению.

6. Эхокардиографическая оценка трансвальвулярной гемодинамики

1. Проведите эхокардиографическую оценку всех выживших мышей через 4 недели после операции для определения степени стеноза аортального клапана.
2. Осуществите индукцию анестезии, поместив животное в индукционную камеру с 3% изофлураном в 100% кислороде. Подтвердите глубину анестезии, убедившись в отсутствии рефлекса отдергивания лапы. Депилируйте переднюю стенку грудной клетки с помощью химического крема для удаления волос. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза для предотвращения высыхания роговицы.
3. Переместите анестезированную мышь на платформу для визуализации с регулируемой температурой в положение на спине.
4. Зафиксируйте лапы к поверхностным электродам электрокардиографа (ЭКГ) для непрерывного мониторинга частоты сердечных сокращений. Титруйте концентрацию изофлурана (обычно 1,0–1,5%) для поддержания стабильной физиологической частоты сердечных сокращений в диапазоне 450–550 ударов в мин.
5. Очистите переднюю стенку грудной клетки и нанесите обильный слой предварительно подогретого акустического контактного геля.
6. Получение изображений в B-режиме
   1. Используя ультразвуковую систему Vevo 3100 с датчиком MX550D (40 MHz), нажмите кнопку управления B-Mode для начала двухмерной визуализации в реальном времени.
   2. Расположите датчик в левой парастернальной позиции для получения длинной оси левого желудочка, аортального клапана и восходящей аорты в парастернальном сечении. Оптимизируйте глубину, ширину и усиление 2D-сигнала.
7. Получение данных в M-режиме и измерение параметров левого желудочка
   1. Из положения длинной оси в парастернальном сечении нажмите кнопку управления M-Mode. Расположите линию сканирования поперек левого желудочка на уровне папиллярных мышц.
   2. Нажмите Start для начала регистрации. После получения стабильной кривой, охватывающей не менее трех сердечных циклов, нажмите Save.
   3. В программе Vevo LAB с помощью инструмента LV Trace обведите эндокард в конце диастолы и конце систолы, зафиксируйте внутренние размеры левого желудочка, толщину передней и задней стенок (LVAWd, LVPWd) и массу левого желудочка.
8. Переместите и измените угол наклона датчика для получения специализированного изображения дуги аорты.
   ​ПРИМЕЧАНИЕ: Получение данного специфического ракурса дуги аорты крайне важно для точного измерения трансвальвулярной скорости, так как это обеспечивает оптимальное совмещение ультразвукового луча с направлением кровотока через аортальный клапан.
9. Цветовое доплеровское картирование
   1. В режиме визуализации дуги аорты нажмите кнопку Color. Расположите цветовое окно над аортальным клапаном и проксимальной частью восходящей аорты.
   2. Отрегулируйте шкалу цветов и усиление так, чтобы систолический струю был четко виден без алиайзинга. Нажмите Start, затем Save.
10. Измерение скорости методом импульсно-волнового доплера
    1. Нажмите кнопку управления PW Doppler. Расположите контрольный объем в самой узкой части струи (vena contracta) и примените коррекцию угла (<60°).
    2. Нажмите Start для начала записи спектральной кривой; после регистрации не менее трех сердечных циклов нажмите Save. В Vevo LAB измерьте пиковую трансвальвулярную скорость с помощью инструмента Peak Velocity, рассчитав среднее значение как минимум по трем циклам.

7. Гистологическая обработка и окрашивание корня аорты

1. После эхокардиографической оценки подтвердите глубокую анестезию, убедившись в полном отсутствии рефлекса отдергивания лапы. Выполните перелом шейных позвонков как вторичный метод эвтаназии в соответствии с Руководством AVMA по эвтаназии животных (издание 2020 г.) и утвержденными в учреждении протоколами.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Трупы животных, иссеченные ткани и материалы, загрязненные кровью, являются биологическими/животными отходами. Утилизируйте их в соответствии с правилами биологической безопасности учреждения и правилами содержания животных.
2. Выполните торакотомию с помощью хирургических микроножниц для обнажения сердца.
3. Введите перфузионную иглу в верхушку левого желудочка и промойте системный кровоток холодным стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Признаком успешной перфузии является обесцвечивание печени и легких.
4. Извлеките целое сердце и погрузите его в 4% параформальдегид (PFA) при комнатной температуре минимум на 24 ч для обеспечения полной фиксации.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Параформальдегид токсичен и вызывает раздражение. Работайте с 4% PFA в химическом вытяжном шкафу, используя соответствующие СИЗ, и утилизируйте отходы PFA как опасные химические отходы.
5. Перенесите фиксированную ткань в автоматический процессор тканей для последовательного обезвоживания через серию градиентных растворов этанола с последующим просветлением ксилолом и инфильтрацией парафином при 65 °C.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Ксилол огнеопасен и токсичен, а горячий парафин может вызвать ожоги. Работайте с ксилолом в вытяжном шкафу или в утвержденном процессоре и утилизируйте отходы, содержащие ксилол, как опасные химические отходы.
6. Залейте обработанные сердца в парафиновые блоки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная ориентация сердца при заливке имеет решающее значение. Расположите сердце так, чтобы можно было выполнить поперечные срезы через корень аорты на уровне трех створок клапана.
7. С помощью ротационного микротома сделайте серийные поперечные срезы толщиной 4–5 µm в плоскости аортального клапана, убедившись, что захвачены все три створки. Закрепите срезы на стеклянных предметных стеклах и храните при комнатной температуре.
8. Выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) выбранных стекол для оценки морфологии тканей, структурного ремоделирования и толщины створок клапана.
9. Выполните окрашивание по методу фон Косса на соседних серийных срезах для обнаружения и количественной оценки дистрофической кальцификации, которая проявляется в виде темно-коричневых или черных минеральных отложений в створках клапана.

8. Имитация хирургической процедуры (ложнооперация)

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном разделе описывается процедура ложнооперированного (sham) контроля. Мыши группы ложнооперированного контроля подвергаются тем же процедурам анестезии, подготовки кожи, обнажения сосуда, артериотомии и ретроградного введения проводника, что и животные в группе с повреждением аорты проволокой (AWI); при этом проводник продвигается до надклапанного уровня, но не проводится через аортальный клапан, и механическое повреждение клапана не выполняется.

1. Проведите анестезию мыши и подготовьте операционное поле, как описано в этапах с 1.1 по 1.5.
2. Под контролем стереомикроскопа обнажите правую общую сонную артерию (RCCA) методом тупой диссекции, как описано в этапе 2.1.
3. Наложите постоянную лигатуру на дистальный конец RCCA шелковой нитью 6-0 и завяжите свободный проксимальный скользящий узел (как в этапах 2.2–2.3).
4. Выполните поперечную артериотомию и введите проводник, как описано в этапах с 3.1 по 4.2.
5. Под контролем эхокардиографии продвигайте проводник в ретроградном направлении до надклапанного уровня восходящей аорты, убедившись, что кончик проводника НЕ пересекает аортальный клапан.
   ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ выполняйте движения по выталкиванию-вытягиванию или ротационные движения, которые могут привести к повреждению клапана, описанные в этапе 4.4. Извлеките проводник и немедленно перевяжите проксимальный отдел RCCA, как описано в этапах 5.1–5.2.
6. Ушейте разрез кожи прерывающимися швами нейлоновой нитью 5-0 или с помощью зажимов для ран.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в группе AWI, интраоперационная анальгезия обеспечивается местной инфильтрацией лидокаином (этап 1.5). Перенесите животное в подогреваемую клетку для восстановления и наблюдайте до полного восстановления двигательной активности.
7. Мышей группы Sham подвергайте такому же послеоперационному мониторингу, эхокардиографической оценке через 4 недели и гистологической обработке, как и мышей группы AWI.

9. Статистический анализ и дизайн исследования

1. В ходе исследования 20 мышам (10 самцов, 10 самок) была проведена процедура AWI, а 6 мышам линии C57BL/6 (3 самца, 3 самки) была проведена имитация процедуры (Sham).
2. Измерьте пиковую трансвальвулярную скорость (критерий, определяющий успех моделирования) у всех выживших животных (19 AWI, 6 Sham).
3. Проанализируйте подробные эхокардиографические и гистологические показатели в заранее определенной сбалансированной по полу подгруппе из 6 мышей AWI (3 самца, 3 самки).
4. Убедитесь, что все эхокардиографические и гистологические измерения проводятся исследователями, не знающими о распределении животных по группам (слепой метод).
5. С помощью теста Шапиро-Уилка проверьте данные на нормальность распределения перед проведением параметрического анализа. Сравните две независимые группы (AWI и Sham) с помощью непарного двухстороннего t-критерия Стьюдента.
6. Проанализируйте и представьте данные о выживаемости с использованием метода Каплана-Мейера.
7. Выполните все анализы в программе GraphPad Prism. Представьте данные как среднее значение ± SEM, где p < 0,05 считается статистически значимым.

Результаты

Разработка платформы с использованием 3D-печати для контроля кровотечения

Для устранения периоперационного кровотечения — основного источника заболеваемости и смертности в традиционной модели AVS с использованием проводника — была разработана 3D-печатная платформа для поддержки сосудов (Рисунок 1). Платформа была изготовлена методом стереолитографии (SLA) из биосовместимой фотополимерной смолы (соответствующей стандартам USP Class VI / ISO 10993) с толщиной конструкции 1,07 mm. После печати детали промывали в изопропиловом спирте для удаления неотвержденной смолы и подвергали последующему отверждению под воздействием ультрафиолетового излучения. Предоставляется полный файл дизайна (.stp), чтобы платформу можно было воспроизвести на стандартных SLA-системах. Платформа имеет перевернутую V-образную апикальную поверхность с углом вершины 120° (Рисунок 1A–B), которая соответствует кривизне изолированной правой общей сонной артерии, не вызывая чрезмерного сжатия стенки. Многочисленные ступенчатые боковые выемки (Рисунок 1C–D) позволяют оператору закрепить заранее наложенные швы и приложить регулируемое продольное натяжение к сосуду. Натяжение увеличивают постепенно до тех пор, пока артериальная пульсация не перестанет быть видимой — этот визуальный конечный результат указывает на адекватный временный гемостаз. Такой подход обеспечивает стабильное операционное поле для артериотомии и введения проводника, позволяя при этом избежать чрезмерного раздавливающего повреждения стенки сосуда.

Интраоперационное подтверждение положения проводника

Правильность расположения проводника проверяли на двух этапах процедуры. Сначала при прямом стереомикроскопическом контроле наблюдали за введением проводника в просвет правой общей сонной артерии (RCCA) через поперечную артериотомию в ретроградном направлении (Рисунок 2A). Затем с помощью эхокардиографии в реальном времени подтвердили, что кончик проводника пересек аортальный клапан и попал в левый желудочек. При визуализации в B-режиме проводник определялся как гиперэхогенный линейный артефакт, пересекающий плоскость аортального клапана (Рисунок 2B). Цветовое допплеровское картирование выявило локальный турбулентный поток на уровне аортального клапана, что послужило дополнительным подтверждением прохождения проводника через створки клапана (Рисунок 2C; Дополнительное видео 1).

Периоперационная выживаемость и доля успешных моделей

Интеграция платформы с регулируемым натяжением в хирургический процесс обеспечила высокий уровень ранней выживаемости. Анализ Каплана-Мейера показал, что выживаемость через 24 ч после операции составила 95% (19 из 20 мышей; Рисунок 3A). Посмертное исследование единственного погибшего животного не выявило признаков массивного кровотечения, структурных повреждений или ишемии миокарда, что позволяет предположить, что смерть была вызвана осложнениями, связанными с анестезией, а не хирургической травмой. Успешность создания модели через 4 недели оценивали по заранее определенному критерию: пиковая скорость трансвальвулярного потока более 2 000 mm/s в сочетании с подтверждающими гистологическими данными. Из 19 выживших животных 18 (94,7%) достигли этого порога, что обеспечило общую успешность модели на уровне 90% для всей когорты (18 из 20 мышей; Рисунок 3B). Результаты были сопоставимы для обоих полов: выживаемость через 24 ч составила 9 из 10 у самцов и 10 из 10 у самок, а показатель успешности модели через 4 недели составил 9 из 10 (90%) для обоих полов; единственный случай периоперационной смерти был зафиксирован у самца (связано с анестезией), а единственный случай неудачи модели — у выжившей самки.

Эхокардиографическое подтверждение аортального стеноза

Трансторакальная эхокардиография через 4 недели после операции подтвердила гемодинамические изменения, соответствующие тяжелому аортальному стенозу в группе AWI. Количественные эхокардиографические показатели представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM); параметры функции и ремоделирования левого желудочка анализировались у 6 мышей группы Sham и 6 мышей группы AWI, в то время как пиковая трансвальвулярная скорость измерялась у всех выживших мышей группы AWI и контрольной группы Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Фракция выброса левого желудочка в группе AWI через 4 недели была несколько ниже, чем в контрольной группе Sham (56,21 ± 1,15% против 61,57 ± 2,12%; p = 0,0503; Рисунок 3C), однако эта разница не достигла статистической значимости. Импульсно-волновая допплерография продемонстрировала выраженное увеличение скорости трансвальвулярной струи в группе AWI, которая достигла 2740,89 ± 104,10 mm/s по сравнению с 988,00 ± 126,24 mm/s в контрольной группе Sham (Рисунок 3D). Количественный анализ подтвердил высокозначимое повышение пиковой скорости трансвальвулярной струи в группе AWI относительно контролей Sham (p < 0,0001; Рисунок 3E). Соответственно ранней фазе адаптации к перегрузке давлением, в группе AWI наблюдалось концентрическое ремоделирование левого желудочка: толщина передней стенки в диастоле была значительно увеличена (LVAWd 1,14 ± 0,02 против 0,96 ± 0,03 mm; p = 0,0016; Рисунок 3F), в то время как толщина задней стенки в диастоле и масса левого желудочка были выше, но не достигли статистической значимости (LVPWd 1,01 ± 0,12 против 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Рисунок 3G; масса LV 124,51 ± 10,63 против 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Рисунок 3H).

Гистопатологическая валидация ремоделирования и кальцификации клапанов

Гистологическое исследование корней аорты подтвердило данные эхокардиографии. Количественные гистологические показатели представлены как среднее ± SEM и были проанализированы для 6 мышей группы Sham и 6 мышей группы AWI. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) в группе AWI выявило выраженное утолщение створок и структурную дезорганизацию, которые отсутствовали в контрольной группе Sham (Рисунок 3I). Количественная морфометрия подтвердила значительное увеличение средней толщины створок клапана в группе AWI по сравнению с группой Sham (p < 0.0001; Рисунок 3J). Окрашивание по методу фон Косса продемонстрировало обширную дистрофическую кальцификацию в утолщенных створках клапанов в группе AWI, которая определялась как темно-коричневые или черные минеральные отложения. В контрольной группе Sham отложения минералов были незначительными (Рисунок 3K). Количественный анализ изображений выявил значительное увеличение общей площади кальцификации (µm²) в группе AWI относительно контроля Sham (p < 0.0001; Рисунок 3L).

Рисунок 1: Конструкция платформы для поддержки сосудов, напечатанной на 3D-принтере, показанная в четырех проекциях. (A) Вид спереди-слева. (B) Вид сзади-справа. (C) Боковой профиль, демонстрирующий общую продольная геометрию платформы. (D) Вид под углом, выделяющий перевернутую V-образную область вершины. Обозначения компонентов: 110, корпус платформы; 120, боковые плечи; 121, ступенчатые боковые выемки; 130, рабочий конец; 140, перевернутая V-образная вершина для вставки; 150, опорная поверхность, контактирующая с сосудом; 160, переходный склон между соседними выемками; 190, правая общая сонная артерия (RCCA). Платформа изготовлена из биосовместимой фотополимерной смолы (структурная толщина: 1.07 mm). Трехмерный структурный чертеж был создан авторами на основе оригинального CAD-файла проектирования (.stp) платформы для поддержки сосудов с использованием FreeCAD, бесплатного программного обеспечения для CAD-визуализации и моделирования с открытым исходным кодом. Сторонние публикации или защищенные авторским правом чертежи не использовались. Оригинальный CAD-файл проектирования доступен в качестве дополнительного файла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Интраоперационное и эхокардиографическое подтверждение положения проводника. (A) Интраоперационная фотография, демонстрирующая ретроградное введение проводника (стрелка) через поперечную артериотомию в просвет правой общей сонной артерии (RCCA) под прямым стереомикроскопическим контролем. (B) Эхокардиографическое изображение в B-режиме, на котором виден проводник (идентифицируется как гиперэхогенный линейный артефакт; стрелка), пересекающий аортальный клапан и входящий в левый желудочек. (C) Эхокардиографическое изображение в режиме цветного допплерокардиографического картирования, демонстрирующее локальный турбулентный поток на уровне аортального клапана, что подтверждает прохождение проводника через створки клапана. Визуализация трансвальвулярного потока в режиме реального времени с помощью цветного допплера при позиционировании проводника представлена в Дополнительном видео 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Показатели выживаемости, гемодинамики, ремоделирования желудочков и гистопатологические результаты оптимизированной модели повреждения аорты проволокой (AWI). (A) Кривая выживаемости мышей AWI по Каплану-Мейеру через 24 ч (n = 20). (B) Успешное (красный) и неудачное (черный) выполнение модели в группе AWI через 4 недели (n = 20); успех определялся как пиковая трансвальвулярная скорость > 2,000 mm/s. (C) Фракция выброса (EF; p = 0.0503). (D) Репрезентативные импульсно-волновые (PW) допплерографические эхокардиограммы мыши из группы Sham (слева) и группы AWI (справа). (E) Пиковая трансвальвулярная скорость (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0.0001). (F) Диастолическая толщина передней стенки левого желудочка (LVAWd; p = 0.0016). (G) Диастолическая толщина задней стенки левого желудочка (LVPWd; p = 0.0650). (H) Масса левого желудочка (p = 0.0961). (I) Репрезентативные срезы корня аорты, окрашенные гематоксилином и эозином (HE) (Sham, слева; AWI, справа). (J) Толщина створки аортального клапана (p < 0.0001). (K) Репрезентативные срезы корня аорты, окрашенные по методу фон Косса (Sham, слева; AWI, справа). (L) Общая площадь отложения кальция (µm²; p < 0.0001). Масштабные отрезки = 500 µm. На всех количественных столбчатых диаграммах столбцы соответствуют средним значениям, а планки погрешностей — стандартной ошибке среднего (SEM). Количественные сравнения между группами Sham и AWI на панелях C, E–H, J и L проводились с использованием двухстороннего непарного t-критерия Стьюдента. Количественные данные получены от групп Sham и AWI (n = 6 на группу), за исключением пиковой трансвальвулярной скорости на панели E, которая измерялась у всех выживших мышей AWI и контролей Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео 1: Цветовое допплеровское ультразвуковое исследование трансвальвулярного кровотока при позиционировании проводника. В видео продемонстрирована визуализация в режиме цветового допплеровского картирования на уровне аортального клапана во время процедуры AWI, что показывает локальный турбулентный поток, вызванный прохождением проводника через створки клапана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данном протоколе представлено детальное описание стабильной и безопасной животной модели аортального стеноза. Особенностью данного подхода является использование вспомогательной платформы, которая облегчает введение проводника в общую сонную артерию. Платформа изготовлена методом стереолитографической (SLA) печати из биосовместимой фотополимерной смолы (структурная толщина 1,07 mm) и имеет перевернутую V-образную апикальную поверхность с углом вершины 120°; полный файл проекта свободно доступен в виде дополнительного файла .stp. Это устройство обеспечивает плавное введение проводника, позволяет объективно контролировать периоперационную потерю крови и тем самым гарантирует краткосрочную и долгосрочную выживаемость мышей в данной модели. С момента первого описания модель, индуцированная проводником, была дополнительно усовершенствована и охарактеризована, включая варианты с различной степенью тяжести, при которых интенсивность повреждения титруется для создания стеноза от легкого до тяжелого¹⁷, а также в недавних отчетах были задокументированы ее периоперационные осложнения¹⁸; настоящий протокол опирается на эти работы, систематически решая проблему периоперационного кровотечения.

Несколько этапов данного протокола являются критически важными для успешного создания модели и заслуживают особого внимания. Во-первых, степень продольного натяжения, создаваемого с помощью 3D-печатной платформы, должна быть точно откалибрована: натяжение следует увеличивать только до тех пор, пока артериальная пульсация не станет визуально незаметной. Недостаточное натяжение приводит к продолжающемуся кровотечению во время артериотомии, тогда как чрезмерное натяжение создает риск повреждения эндотелия и разрыва сосуда. Во-вторых, проксимальный скользящий узел должен быть надежно затянут вокруг сосуда и проводника перед удалением платформы; преждевременное удаление платформы при недостаточно закрепленном узле является наиболее частой причиной кровоизлияния во время процедуры. В-третьих, необходимо подтвердить введение проводника в левый желудочек под контролем эхокардиографии. Без этого этапа проверки оператор не может быть уверен, что проводник правильно позиционирован у аортального клапана, и неполное повреждение приведет к неудаче при создании модели.

Можно ожидать и контролировать несколько распространенных осложнений. Если при введении проводника возникает кровотечение, платформу следует перепозиционировать под сосуд для восстановления временного гемостаза перед продолжением процедуры. У животных с сонными артериями меньшего калибра небольшое снижение натяжения платформы может расширить просвет сосуда для размещения проводника. Данная модель имеет несколько ограничений, которые следует учитывать при интерпретации результатов. Механическое повреждение проволокой вызывает острое механическое и воспалительное повреждение клапана, что отличается от хронического, липид-зависимого дегенеративного процесса, характерного для кальцифицирующего аортального стеноза у людей^17,19,20,21. Следовательно, гистологические признаки — хотя и воспроизводят утолщение створок и дистрофическую кальцификацию — могут не полностью повторять все молекулярные события человеческого заболевания. Протокол был разработан и валидирован на мышах линии C57BL/6 обоих полов в возрасте 8–10 недель; однако применимость к другим линиям или старым животным требует независимой валидации. Половые различия в диаметре сонной артерии и анатомии сердца могут влиять на сложность операции и гемодинамические исходы; исследователям рекомендуется указывать пол как биологическую переменную в последующих анализах²². Кроме того, постоянное лигирование правой общей сонной артерии является неотъемлемой частью процедуры; хотя Виллизиев круг обеспечивает коллатеральную перфузию головного мозга у мышей и явных неврологических нарушений не наблюдалось, нельзя исключать незначительные когнитивные или цереброваскулярные эффекты. Исходная (допроцедурная) эхокардиография не проводилась; соответствующая ложнооперированная группа служила контролем нормального функционирования клапана; при возможности рекомендуется проведение исходного сканирования для обеспечения внутриживотного сравнения и выявления редких спонтанных аномалий аортального клапана, зарегистрированных у мышей C57BL/6 (~0,3% в немодифицированных линиях). Аортальная недостаточность в данном исследовании систематически не оценивалась; частота вызванной повреждением аортальной недостаточности и ее связь со степенью тяжести стеноза требуют отдельной оценки и будут рассмотрены в будущих работах.

Также следует рассмотреть потенциальные недостатки данной платформы. Устройство может оказывать механическое раздражение прилегающих структур, включая блуждающий нерв, который проходит вдоль сонной артерии; этот риск минимизируется за счет закругленных тупых краев платформы, её вершины с углом 120°, соответствующим форме сосуда, а также кратковременности применения. В данном исследовании не было отмечено нарушений дыхания или других явных осложнений, вызванных устройством. По сравнению с общепринятыми альтернативными подходами, этот оптимизированный протокол обладает несколькими практическими преимуществами. Диетические модели на мышах ApoE⁻/⁻ требуют 20–24 недель кормления жирами и приводят к вариативности стенотических фенотипов, при этом у многих животных не развивается гемодинамически значимое заболевание. Настоящий протокол позволяет получить стабильный стенотический фенотип в течение 4 недель с общим процентом успеха 90% (18 из 20 животных). По сравнению с оригинальным методом Honda с использованием проводника, основным преимуществом данного протокола является систематический контроль периоперационного кровотечения с помощью 3D-печатной платформы.

Кровотечение при введении проводника признано осложнением оригинальной методики, однако этой проблеме уделялось недостаточно внимания. По данным ретроспективного опыта той же лаборатории при использовании традиционной процедуры (без платформы, более 400 случаев), значительное интраоперационное кровотечение наблюдалось примерно в 40% случаев, при этом летальность после кровотечения составила ~60%, а выживаемость через 24 часа — ~75%, причем кровотечение — главным образом в месте доступа к сонной артерии — стало основной причиной практически всех периоперационных смертей. Это согласуется с данными Qian et al., которые определили кровотечение в месте пункции сонной артерии как главную причину периоперационной смерти в данной модели. Благодаря контролю кровопотери использование 3D-печатной платформы повысило 24-часовую выживаемость до 95%, при этом в данной когорте не было зафиксировано смертей, вызванных кровотечением. Поскольку кровотечение больше не является основным ограничивающим фактором, интенсивность механического повреждения может варьироваться для создания различной степени тяжести стеноза. Такая возможность настройки имеет прямое трансляционное значение: для потенциальных терапевтических средств с умеренным эффектом может потребоваться более выраженное исходное повреждение, чтобы выявить различия, связанные с лечением, которые в более легкой модели могли бы остаться незамеченными.

Данная модель хорошо подходит для нескольких категорий последующих исследований. Поскольку стенотический фенотип развивается в определенные и воспроизводимые временные сроки, модель может служить платформой для доклинической оценки потенциальных методов фармакологической терапии, направленных на замедление кальцификации или фиброза клапана²³. Модель также совместима с генетическими подходами: данный протокол может быть применен к трансгенным или нокаутным мышам на генетическом фоне C57BL/6 для анализа вклада конкретных сигнальных путей в прогрессирование заболевания клапана. Кроме того, конечная точка через 4 недели предоставляет практическое окно для последовательного эхокардиографического мониторинга развития заболевания или ответа на лечение. Файлы дизайна 3D-печатной платформы могут быть свободно переданы в виде дополнительного файла в формате .stp, а стандартизация этого устройства между лабораториями, как ожидается, позволит дополнительно повысить воспроизводимость результатов между различными центрами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Платформа для поддержки сосудов, напечатанная на 3D-принтере	Индивидуальное изготовление	Н/Д	Индивидуальная платформа для поддержки сосудов, напечатанная на 3D-принтере; прилагается дополнительный CAD-файл в формате .stp.
4% параформальдегид	Servicebio	G1101-3ML	Фиксация тканей
Нейлоновая шовная нить 5-0	Jinhuan Medical	F503	Закрытие кожи прерывистыми швами
Шелковая шовная нить 6-0	Jinhuan Medical	RC411	Перманентное лигирование дистального отдела правой общей сонной артерии (RCCA) и проксимальный скользящий узел
Акустический контактный гель (предварительно нагретый)	Keppler	KL-250	Эхокардиография
Биосовместимая фотополимерная смола	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Материал для SLA-печати, использованный для изготовления индивидуальной платформы для поддержки сосудов на 3D-принтере.
Мыши C57BL/6 (8–10 недель; самцы 22–25 г, самки 18–20 г)	GemPharmatech	C57BL/6	Использованы оба пола; содержание в стандартных условиях
Газ этиленоксид	Институциональный центр стерилизации	Н/Д	Стерилизация индивидуальной платформы для поддержки сосудов, напечатанной на 3D-принтере.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	CAD-визуализация и создание 3D-чертежа конструкции из файла .stp.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	Статистический анализ и построение графиков
Проводник, диаметр 0,014 дюйма	Boston Scientific	H749393071900	Механическое повреждение клапана аорты
Набор для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E)	Beyotime	C0105S	Морфология и толщина створок
Изофлуран	RWD Life Science	R510-22-2	3% для индукции; 1,5–2% для поддержания в 100% O2
Лидокаин	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	Предварительная местная инфильтрация в месте разреза (0,5%, шаг 1.5)
Микрохирургические ножницы	RWD Life Science	F11022-11	Разрез кожи, артериотомия, торакотомия
Датчик MX550D (40 МГц)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	Эхокардиография
Крем для удаления волос Nair	Nair	255 г	Для депиляции передней поверхности шеи и грудной клетки
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	Перфузия
Ротационный микротом	Leica Biosystems	RM2125 RTS	Серийное срезание с толщиной 4–5 µm
Стереомикроскоп (хирургический)	Olympus	SZX7	Изоляция сосудов и микрохирургия
Система ультразвуковой диагностики высокого разрешения Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	Эхокардиография
Набор для окрашивания по методу фон Косса	Servicebio	G1043-20ML	Выявление дистрофической кальцификации
Ксилол	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	Прозрачивание тканей при обработке парафином.