Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

Данная процедура начинается с подготовки морфолино и in vitro транскрибированной кэпированной мРНК. Микропипетку заполняют, всасывая раствор, содержащий морфолино, после чего калибруют объем инъекции с помощью микрометрического столика для одной клетки. Затем собирают эмбрионы zebrafish и помещают их в камеру для микроинъекций с целью введения препаратов в желток.

Рабочий раствор вводится в желток сразу под клеткой, после чего за счет цитоплазматических движений раствор перемещается для микроинъекций в клетку. После проведения инъекций введите раствор в цитоплазму клетки. Инкубируйте эмбрионы при температуре 28.5 °C в среде E3 и оценивайте наличие интересующих фенотипов на последующих стадиях развития.

Здравствуйте, я Шайло Юэн из лаборатории доктора Саши и кафедры генетики медицинской школы Йельского университета. Сегодня мы продемонстрируем надежный метод микроинъекций для проведения исследований по гиперэкспрессии мРНК и нокдауну генов с помощью морфолино-олигонуклеотидов у zebrafish. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения роли первичных ресничек при кистозных заболеваниях почек.

Итак, приступим. Одним из эффективных подходов к изучению функций генов является микроинъекция в эмбрионы zebrafish РНК с кэп-структурой, транскрибированной in vitro. В данной демонстрации мы выполним микроинъекцию транскрипта с меткой EGFP и будем использовать экспрессию GFP в живом целом эмбрионе в качестве видимого индикатора успешного введения.

Сначала мы проведем реакцию транскрипции кэпированной РНК in vitro для интересующего нас транскрипта. В нашей лаборатории мы регулярно вставляем соответствующую кДНК в вектор pCS2+, после чего проводим реакцию синтеза in vitro больших количеств кэпированной РНК с использованием набора Mmessage mMachine SP6. Затем мы очистим образец РНК с помощью набора RNeasy Mini или путем фенол-хлороформной экстракции и осаждения изопропанолом.

Тщательно определите концентрацию препарата РНК и храните его при температуре -80 °C до дня проведения инъекций. Разморозьте образец РНК, подвергните легкому перемешиванию на вортексе и кратковременно центрифугируйте. Теперь приготовьте рабочий раствор со стерильной водой и конечной концентрацией фенолового красного от 0,025 до 0,05%; феноловый красный служит видимым маркером для контроля введения раствора в эмбрион.

Здесь мы подготовим рабочий раствор мРНК EGFP в концентрации 100 нг/мкл с добавлением 0,05% фенолового красного. В завершение выдержите рабочий образец на льду, а исходный запас РНК верните при температуре -80 °C. Приступайте к подготовке морфолино, когда будете готовы к инъекции данного образца.

Антисмысловые олигонуклеотиды Morino широко используются для модификации экспрессии генов путем блокирования трансляции целевого белка или модификации сплайсинга пре-мРНК. Морфолино в моделях zebrafish служат мощным инструментом обратной генетики для нокдауна функций генов. В данном видео мы проведем микроинъекцию морфолино-олигонуклеотида, нацеленного на сайт инициации трансляции pkd2. Мы обычно используем 300 M морфолино-олигонуклеотида, специально разработанного для интересующего гена и полученного от Gene Tools LLC.

Затем мы добавляем 100 µL стерильной воды для приготовления стокового раствора с концентрацией 3 mM, после чего разделяем раствор на аликвоты и храним при температуре -20 °C до дня инъекции. Мы нагреваем раствор morino при 65 °C в течение пяти минут. Затем мы немедленно подвергаем раствор резкому охлаждению на льду и кратковременно центрифугируем; этот этап денатурирует любые вторичные структуры олигонуклеотида и обеспечивает полное растворение вещества.

Затем мы приготовим рабочий раствор, разбавив раствор Morpho стерильной водой до конечной концентрации фенолового красного от 0,025 до 0,05%. В данной демонстрации мы приготовим рабочий раствор 0,5 мМ PKD2-MORINO с 0,05% фенолового красного. Храните рабочий раствор при комнатной температуре и переходите к заполнению микропипетки, когда будете готовы ввести этот образец.

Для начала необходимо изготовить микропипетки, которые будут использоваться для инъекций. Это делается путем нагрева и вытягивания капиллярных трубок из силикатного стекла BOS в устройстве для вытягивания микропипеток. После вытягивания иглы хранят в чашке Петри, закрепив их на небольшом количестве глины или клейкой ленте.

Затем мы подготовим планшеты для микроинъекций, налив 1,5% агарозы в три чашки Петри среднего размера, имеющие форму клиновидных желобков. Это послужит простым способом фиксации эмбрионов во время инъекции. Затем планшеты с агарозной камерой оставляют до затвердевания и хранят при температуре четырех градусов Цельсия до начала использования.

Для начала заполнения микропипетки обрежьте дистальный кончик с помощью пинцета или хирургического лезвия, чтобы создать отверстие, которое будет едва заметно под диссекционным микроскопом при 50-кратном увеличении. Затем нанесите 2 µL вашего рабочего раствора.

Поместив каплю на покровное стекло, прикрепите заднюю часть микропипетки к пятимиллилитровому шприцу, оснащенному трубкой с иголкой, и слегка погрузите дистальный конец микропипетки в каплю рабочего раствора. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончик микропипетки. Перенесите рабочий раствор через дистальный конец микропипетки, потянув поршень шприца.

Далее мы откалибруем объем инъекции микропипетки. Нанесите каплю минерального масла на предметное стекло с микрометрической шкалой, затем включите питание и подачу воздуха в аппарат для микроинъекций с импульсным давлением. После этого закрепите микропипетку в держателе микропипетки аппарата для микроинъекций.

Микроинъектор работает с регулируемым давлением, а подача раствора активируется нажатием ножной педали под диссекционным микроскопом. Проверьте объем инъекции, используя микроинъектор для нанесения капли рабочего раствора на микрометрическое масло. Измерьте диаметр капли, которая будет плавать в виде сферы на поверхности масла.

Отрегулируйте продолжительность и давление инъекции, чтобы тщательно откалибровать объем вводимого вещества. Этот этап способствует воспроизводимости эксперимента по микроинъекции. В данной демонстрации все микроинъекции будут проводиться с диаметром капли 0,15 мм.

Наконец, после калибровки объема инъекции, используйте ручку удержания (hold knob) микроинъектора, чтобы предотвратить обратный затек и утечку из микропипетки. Теперь приступайте к подготовке эмбрионов zebrafish. Zebrafish спариваются случайным образом; в первые несколько часов каждого утра для начала подготовки соберите эмбрионы на стадии одной клетки и поместите их в среду XE 3.

С помощью трехмиллилитровой трансфер-пипетки расположите эмбрионы вдоль клиновидных желобков в планшетах камеры для микроинъекций. Удалите излишки среды так, чтобы эмбрионы были слегка погружены, но не залиты. Этот этап способствует оседанию эмбрионов на дно желобков, а также облегчает проникновение микропипетки сквозь хорион.

Теперь приступим к инъекциям. Сначала с помощью микропипетки переместите эмбрионы так, чтобы цитоплазма эмбриона на стадии одной клетки была видна под стереомикроскопом. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончик микропипетки; проколите хорион, а затем желток, чтобы ввести вещество в эмбрион.

В данной демонстрации мы сначала выполним микроинъекцию в желток непосредственно под клеткой, позволяя цитоплазматическому току и диффузии доставить рабочий раствор в клетку. Этот поток виден благодаря феноловому красному, добавленному в рабочий раствор. Поскольку это одноклеточный эмбрион, инъекцию можно проводить вручную или с помощью манипулятора.

Мы также продемонстрируем прямую инъекцию в цитоплазму клетки. Прямая микроинъекция в клетку более надежна, но трудозатратна, так как требует правильной ориентации эмбриона и соответствующей техники микроинъекции. Поскольку клеточная мембрана более плотная, чем мембрана желтка, зачастую быстрее ввести микропипетку через желток, чтобы достичь клетки.

Ориентация цитоплазмы таким образом, чтобы анимальный полюс был направлен к дну желоба, а также уверенность движений рук могут облегчить выполнение данного метода инъекции. После микроинъекции поместите эмбрионы в чашку Петри со средой E three и инкубируйте их при температуре 28,5 °C для нормального развития. В течение последующих нескольких часов и дней развития эмбрионов наблюдайте за ними для выявления интересующих вас фенотипов.

Для подтверждения успешности микроинъекции мы будем контролировать экспрессию GFP в развивающихся эмбрионах, начиная со стадии щита, с помощью флуоресцентной микроскопии всего эмбриона in vivo. Экспрессия конструкции наиболее выражена на ранних этапах эмбрионального развития и часто снижается по мере развития, поскольку инъецированная кэпированная РНК постепенно деградирует, и итоговый результат зависит от стабильности экспрессируемого белка. Основываясь на ранее опубликованных результатах, мы ожидаем, что морфино PKD two будет имитировать изгиб дорсальной оси тела, характерный для мутантных zebrafish PKD two, и приведет к появлению кист в почках примерно через два-три дня после оплодотворения.

Мы только что продемонстрировали надежный метод микроинъекций для проведения исследований по гиперэкспрессии мРНК и нокдауну генов с помощью морфолино-олигонуклеотидов у данио-рерио. При выполнении этой процедуры помните о важности следующего: проводите инъекции уверенной рукой. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.