Фокусное Ca ^{2 +} Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре

Сначала подготавливают раствор для загрузки кальция, прогревают его и продувают газом. Мочевой пузырь извлекают путем диссекции, вскрывают, расправляют с помощью фиксирующих игл и вырезают полоску детрузора. Полоску детрузора переносят в раствор для загрузки, инкубируют, промывают и расправляют с помощью фиксирующих игл.

Флуоресцентный индикатор кальция в ткани возбуждается лазерным излучением, и регистрируется излучаемый свет. Полученные видеозаписи, состоящие из отдельных кадров, анализируются путем сравнения последовательных кадров. Производится вычитание фона.

Порог края клетки определяет область поиска событий, после чего рассчитывается соотношение между последовательными срезами мозга. Если оставшиеся события соответствуют заданным критериям, они выделяются и маркируются. Здравствуйте, меня зовут Джон Янг, я представляю лаборатории Кита Брейна и Тома Кинана кафедры фармакологии Оксфордского университета.

Я — Роб Амос, также из лабораторий Брейна и Кэнн, а меня зовут Кит Брейн. Сегодня Джон и Роб продемонстрируют вам метод визуализации кальция в гладких мышцах. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения высвобождения нейромедиаторов из вегетативных нервов и их воздействия на гладкую мускулатуру.

Итак, приступим. Индикатор кальция Organ Green 488 calcium indicator поставляется во флаконах объемом 500 µL, содержащих 50 µg порошка. Чтобы приготовить индикатор кальция, добавьте 40 µL раствора DMF к порошку и осторожно перемешивайте в течение 30 секунд; после этого добавьте 460 µL физиологического раствора (PSS) и снова осторожно перемешивайте в течение 30 секунд.

Конечный раствор Organ Green 488 باFTA в концентрации 10 µM разделяют на четыре аликвоты по 125 µL каждая. Чтобы избежать воздействия света, раствор следует хранить при температуре -20 °C до начала препарирования интересующей ткани.

Достаньте индикатор кальция из морозильной камеры и разморозьте его при комнатной температуре, пока индикатор не станет жидким. Поместите один миллилитр PSS в пробирку и установите ее в водяную баню при температуре 33 °C. Закрепите барботизатор в пробирке с помощью пробки (или можно использовать перфлюр) и проведите барботирование смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа со скоростью примерно один пузырек в секунду.

Выделите орган из гладкой мускулатуры животного. В данном случае это мочевой пузырь мыши. Поместите орган примерно в 50 миллилитров PSS для промывки; после тщательного промывания ткани аккуратно удалите окружающую жировую и соединительную ткань.

Выполните вскрытие мочевого пузыря в соответствии с методом для гладких мышц. Сделайте продольный разрез от шейки мочевого пузыря, через каудальный конец, до вершины купола. На краниальном конце подготовьте четыре полоски длиной 6–8 мм и шириной 1–2 мм вдоль дорсальной поверхности, выполняя разрезы в направлении доминирующих мышечных пучков.

Поместите препарированную ткань и предварительно прогретый и продутый PSS для загрузки индикатора кальция (125 µL 10 µM Organ Green 488B) в пробирку к ткани и слегка встряхните её вручную для перемешивания. Верните пробирку в водяную баню. Возобновите продувку и накройте водяную баню листом фольги.

Время, необходимое для достаточного поглощения кальциевого индикатора тканью, варьируется в зависимости от размера ткани и толщины слоя гладких мышц. Например, для детрузора мыши и oxs крысы это время составляет 70 минут. В то время как для детрузора крысы и VAs deens мыши инкубация проводится в течение 120 минут.

После насыщения ткани индикатором кальция ее можно подготовить к микроскопии. Сначала промойте ткань в аэрированном PSS в течение 10 минут. Затем поместите ткань в чашку для препаратов с S-guard.

Слегка растяните ткань, чтобы она образовала плоский лист. Зафиксируйте ткань, используя короткие отрезки, например, 2 мм серебряной проволоки диаметром от 25 до 50 µm, и введите булавки под углом.

Избегайте использования булавок длиной более нескольких миллиметров, так как они могут поцарапать объектив. Тщательное закрепление ткани булавками важно для минимизации спонтанного смещения ткани и облегчения поиска подходящего участка для визуализации. После закрепления ткани поместите чашку с препаратом на предметный столик микроскопа.

Следите за тем, чтобы PSS не выходил за пределы области чашки, ограниченной силиконовым защитным барьером, так как это может привести к покрытию PSS большой площади. Когда суперфузия начнется для целей демонстрации, следующие шаги будут выполняться при свете.

Обратите внимание, что данные эксперименты обычно проводятся в темноте. Включите насос для перфузии препарата. При использовании PSS часто применяется скорость 100 milliliters per hour.

Включите нагревательный блок, разместите трубки притока и оттока, а также температурный датчик на чашке с препаратом, закрепив каждую из них на металлической полосе с помощью магнита на основании. Высота конца трубки оттока определит глубину PSS. Следите за тем, чтобы отток действительно удалял PSS, так как иногда этого не происходит.

Сначала установите на нагревательном устройстве необходимую температуру в диапазоне от 33 до 35 °C. Дайте ткани стабилизироваться в течение не менее 10 минут, используя объектив с малым увеличением (10x или 20x).

Используйте эпифлуоресцентный микроскоп или возбуждение синим светом для визуализации гладких мышц и выбора подходящего участка для мониторинга. Поскольку воздействие возбуждающего освещения вызывает фотовыгорание индикатора, не используйте освещение более нескольких секунд за один раз.

Избегайте участков с ярко выраженными структурами, так как они могут привести к большому количеству ложноположительных результатов в алгоритме распознавания изображений. Постарайтесь выбрать участок с минимальной подвижностью и большим количеством гладкомышечных клеток в поле зрения. После выбора участка для съемки переключитесь на объектив с большим увеличением, например 40 x.

Поверните предметный столик или оптическую ось так, чтобы гладкомышечная клетка или группа клеток располагались горизонтально, то есть параллельно оси быстрого сканирования. Теперь гладкомышечные клетки готовы к визуализации с помощью конфокальной микроскопии.

В данном протоколе мы используем вертикальный конфокальный микроскоп Leica SP2. Установите диафрагму (pinhole) на один диск Эйри. Настраиваемый фильтр Custo Optic установите на мощность лазера от 25 до 35%.

Данное значение представляет собой компромисс между яркостью и фотообесцвечиванием. Для подготовки к анализу данных скачайте и установите ImageJ. Загрузите версию для вашей операционной системы, затем обновите программу до последней версии, скачав актуальный jar-файл ImageJ и заменив им старый файл. После этого скачайте jar-файл Excel writer и установите его в директорию plugins.

Скопируйте эти файлы в директорию плагинов. Установите каждый из этих скриптов с помощью макросов плагинов. Установите функцию ImageJ. Программное обеспечение для используемого нами конфокального микроскопа Leica SP2 называется Leica.

LCS сохраняет отдельные кадры каждой серии в виде отдельных файлов. Для реконструкции серии убедитесь, что все кадры, подлежащие реконструкции, находятся в одной папке.

Например, папка с данными tiffs. Затем выберите макрос Leica SP two stacker в меню Plugins > Macros. Выберите корневой каталог, в данном случае — папку с данными.

Выберите нужную папку из выпадающего списка. В данном случае выберите выходной каталог для tiffs или создайте новый. Например, папка data folder stacks.

Затем скрипт восстановит серии из отдельных кадров, чтобы скорректировать смещение. Мы используем общедоступный алгоритм, который выравнивает или сопоставляет кадры внутри серии в стеке загрузок: rig и turbo reg. Скопируйте соответствующие файлы в папку stacks.

Загрузите стек для обработки, затем перейдите к кадру, на котором четко видна интересующая область. Остальные кадры будут выровнены относительно этого опорного кадра. После этого перейдите в меню Plugins → Stacks.

Регистрация стека. Попробуйте применить каждое из различных преобразований, чтобы определить наиболее эффективное для каждого участка. Факторы визуализации, влияющие на детектирование кальциевых транзиентов, будут варьироваться в зависимости от измерения определенных свойств и параметров частиц каждого участка.

Чувствительность и специфичность детекции повышаются. Таким образом, для каждого участка мы рассчитаем пороговое значение для вычитаемого порога отношения и пороговое значение края клетки. Для начала перейдите в plugins, macros, install и выберите jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Затем перейдите в plugins macros load stack.

Выберите серию и рассчитайте следующие параметры частиц. Для расчета порога вычитания (subtracted) выберите прямоугольную область интереса там, где, по вашему мнению, находится фоновый сигнал. Запишите среднее значение. Для расчета порога отношения (ratio) выберите прямоугольную область интереса вокруг оптически плоского участка гладкомышечной клетки или клеток.

Измерьте и запишите среднее значение и стандартное отклонение. Повторите этот процесс еще два раза или выделите три области одновременно, удерживая клавишу shift. Рассчитайте и запишите пороговое значение коэффициента.

Рассчитайте значение как стандартное отклонение, деленное на среднее плюс единица, затем умножьте результат на 32. При усреднении значений по трем повторностям множитель 32 необходим для учета алгоритма вычисления соотношения, при котором отсутствие изменений по сравнению с предыдущим кадром соответствует целочисленному значению 32. Это обеспечивает достаточный динамический диапазон для обнаружения увеличения и уменьшения соотношения.

Для восьмибитного изображения выберите «Adjust Threshold» (Настройка порога). Выберите «Black and White» (Черно-белый). Определите верхний предел слайдера и запишите соответствующее значение.

Это находится справа от ползунка. Будут учтены только события, происходящие в черных областях. Нажмите «сброс».

После расчета порогового значения для вычитания отношения и порогового значения края клетки можно приступить к анализу стеков изображений. Определите расположение стеков, которые необходимо проанализировать. На данном этапе выберите только одну серию.

Это первый файл; последний файл должен быть таким же. Затем выберите местоположение для вывода файлов данных и стеков. Например, выходную папку данных.

Введите значения порога вычитания, порога соотношения и порога краев клеток. Остальные настройки оставьте по умолчанию. Алгоритм создаст двухпанельное окно, в котором обработанная серия будет отображена слева, а исходная — справа.

Откройте этот файл из выходной папки и внимательно изучите его, чтобы оценить количество ложноположительных результатов и случаев, когда события, видимые невооруженным глазом, не были обнаружены. Для каждой серии алгоритм создает файл Excel, в котором подробно описаны характеристики обнаруженного события, такие как амплитуда, площадь и положение; ложноположительные результаты, выявленные при просмотре выходных изображений алгоритма, могут быть удалены из этого файла Excel вручную. При этом следует придерживаться строгих критериев удаления.

На данном видео продемонстрирована динамика кальциевых транзиентов в гладких мышцах. В этом примере видео состоит из 100 отдельных кадров, полученных с частотой 5 Гц. При исследовании, например, влияния конкретного препарата на частоту кальциевых транзиентов в рамках одного эксперимента записывается множество таких видеороликов.

Здесь мы видим многочисленные спонтанные кальциевые транзиенты в гладкомышечных клетках. Здесь представлен результат работы алгоритма детектирования частиц. Для каждой серии алгоритм создает файл Excel, в котором подробно описаны характеристики обнаруженного события, такие как амплитуда, площадь и положение.

Таким образом, мы продемонстрировали метод визуализации кальциевых транзиентов в гладкомышечных органах, таких как мочевой пузырь, а также способ анализа этих транзиентов с помощью алгоритма, разработанного в нашей лаборатории. Важно помнить о необходимости тщательной подготовки ткани для визуализации кальция. В случае с тканью, которую мы рассматривали сегодня, это подразумевает удаление соединительной ткани и любого жира, которые могут перекрывать поле зрения.

Также важно закрепить ткань в расправленном виде. Желаем успехов в ваших экспериментах и благодарим за просмотр.