Пакетный Иммуноокрашивание крупномасштабных белка Обнаружение в весь мозг обезьяны

Данная процедура начинается с получения перфузированного 4% PFA, экстернализированного и криопротектированного мозга, который был направлен в Neuroscience associates для заливки с использованием ориентиров выравнивания, встроенных в окружающий матрикс. Мозг можно распиливать в корональной плоскости для получения серийных срезов желаемой толщины, представляющих всю передне-заднюю протяженность мозга, с применением специализированных корзин и контейнеров. Для определения пространственного паттерна экспрессии белка во всем мозге может быть проведена групповая иммунообработка.

Здравствуйте, я доктор Шахин Зур из Лаборатории визуальных нейронаук Школы оптометрии Монреальского университета. Здравствуйте, я доктор Марк Бёрк, также из Лаборатории визуальных нейронаук Школы оптометрии Монреальского университета. Здравствуйте, я доктор Мо Петто, директор Лаборатории визуальных нейронаук Школы оптометрии Монреальского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру серийного иммуноокрашивания для крупномасштабного детектирования белков в целом мозге обезьяны. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения паттернов экспрессии целевых белков во всем мозге, а также для сравнения экспрессии этих белков в пределах одного и того же мозга. Итак, приступим.

Перед началом гистологической обработки подготовьте мозг примата, который был законсервирован путем системной перфузии, подвергнут постфиксации и криопротекции с использованием растворов сахарозы различной концентрации. На этом этапе мозг направляется специалистам по нейронаукам для заливки и серийного секционирования с применением их запатентованной технологии. После возврата образцов можно заметить, что в матрицу для заливки помещены семь ориентиров, которые позволяют правильно ориентировать срезы и выравнивать их после завершения гистологической обработки.

Во время выполнения секционирования делают цифровые снимки, которые впоследствии могут быть использованы для 3D-реконструкции анатомических карт. Сотрудники-нейробиологи обрабатывают нашу ткань для получения серийных свободно плавающих коронарных срезов толщиной 50 micrometer по всему мозгу. После завершения этого процесса мы можем приступить к гистологической обработке срезов.

При начале гистологической обработки мы обычно работаем примерно со 140 срезами на одно антитело или один краситель. В данном примере мы продемонстрируем технику на меньшем количестве срезов, обработанных антителом SMI 32, которое представляет собой моноклональное антитело к нефосфорилированным белкам нейрофиламентов. На протяжении всей процедуры используются специализированные лотки и корзинки для окрашивания, что позволяет одновременно и эффективно обрабатывать большое количество свободно плавающих срезов.

Это обеспечивает однородность окрашивания всех срезов. На первом этапе срезы инкубируют в растворе на основе PBS, содержащем TRITTON X 100 и нормальную сыворотку лошади, в течение 60 минут. Это позволит снизить неспецифическое связывание молекул антител, которое приводит к фоновому окрашиванию.

Затем срезы инкубируют в течение ночи. На следующий день срезы трижды промывают по 10 минут в промывочном растворе, а затем инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре в растворе антител SMI 32 на основе PBS с добавлением Triton X 100 и нормальной сыворотки лошади, а после — в растворе биотинилированных вторичных антител Muse на основе PBS, содержащем Triton X 100 и нормальную сыворотку лошади.

После серии из трех дополнительных промывок по 10 минут срезы помещают в раствор комплекса Avadon biotin, конъюгированного с пероксидазой хрена, на один час при комнатной температуре. В завершение, после еще одной серии промывок, срезы подвергают реакции с D-аминобензидином в течение 10 минут, что приводит к появлению коричневого окрашивания внутри иммунореактивных нейронов. Затем реакцию останавливают, извлекая корзину с образцами и погружая срезы в PBS.

После двух-трех пятиминутных промывок в PBS срезы готовы к индивидуальному закреплению на предметных стеклах. Процесс закрепления проводят с использованием большой чашки Петри и очень мягких кистей для рисования. Срезы извлекают из контейнера с буфером PBS и по отдельности переносят на предметные стекла, покрытые желатином. Затем образцы оставляют для высыхания на воздухе в вытяжном шкафу на ночь.

Срезы промывают, погружая их в деионизированную воду, чтобы удалить кристаллы соли, которые могли остаться после процесса заливки. Затем предметные стекла обезвоживают в серии спиртовых растворов возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле и заключают с помощью среды для заключения PerMount. На этом этапе предметные стекла следует хранить в горизонтальном положении примерно от одной недели до 10 дней, чтобы среда для заключения полностью затвердела.

После этого предметные стекла можно хранить в контейнере для стекол или подвергнуть визуализации с помощью микроскопии. Данный метод позволяет получить полный профиль экспрессии интересующего целевого белка во всем мозге обезьяны. Здесь представлены репрезентативные корональные срезы, демонстрирующие экспрессию FMRP, neuN и SMI 32.

В том же мозге обезьяны. Мы только что продемонстрировали, как провести серийное иммуноокрашивание целевого белка во всем объеме мозга. При выполнении данной процедуры важно обеспечить умеренное перемешивание всех срезов во время инкубации в различных растворах, а также следить за тем, чтобы они постоянно оставались полностью погруженными в жидкость.

Кроме того, не торопитесь при изготовлении микропрепаратов и постарайтесь максимально разгладить все складки и заломы, не нарушая целостности ткани. На этом все. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.