Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

Данная процедура начинается со сбора эмбрионов на чашки со свежим виноградным соком через 30–60 минут. После извлечения чашки из озерной клетки соберите эмбрионы с помощью увлажненной кисточки и поместите их на двусторонний скотч. Осторожно перекатите один эмбрион по ленте, используя одну сторону пинцета, до тех пор, пока хорион не разорвется.

Поднимите эмбрион и аккуратно поместите его на покровное стекло. Нанесите слой клея HET. Повторяйте эти действия, пока не будет собрано достаточное количество эмбрионов.

После обезвоживания эмбрионы готовы к инъекции. Здравствуйте, я Ингрид Брюс Машер из лаборатории доктора Джонатана Скалли с кафедры молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Дейвисе. Сегодня мы продемонстрируем процедуру микроинъекции синцитиальных эмбрионов Drosophila.

Мы используем данную процедуру для изучения роли микротрубочек и митотических моторных белков в митозе. Например, мы осуществляем микроинъекции антител или других ингибиторов специфических белков митоза. Анализируя влияние ингибитора на митоз, мы можем определить функцию белков-мишеней.

Приступим к работе. Для начала подготовки за два-три дня до проведения эксперимента соорудите клетку для сбора яиц: прорежьте два небольших отверстия размером примерно 1 см² с противоположных сторон пластиковой бутылки. Заполните отверстия кусочками ваты, обеспечив при этом приток воздуха.

Перебейте мух в флакон и накройте его чашкой с виноградным соком. В случае использования дрожжей держите клетку для ног при комнатной температуре; мухи будут откладывать яйца в течение до 10 дней, начиная как минимум за один день до эксперимента. Подготовьте иглы для инъекций и храните их при температуре 4 °C.

В день проведения эксперимента подготовьте и загрузите иглы. Сначала извлеките помеченный тубулин из морозильной камеры и поместите его на лед на 5–15 минут. Затем разведите его буфером GPEM и центрифугируйте в течение 10–15 минут при 13 000 RPM и 4 °C.

Наконец, внесите от одного до двух µL в иглу и храните её при температуре 4 °C, чтобы предотвратить индуцированную температурой полимеризацию в игле. Перед установкой покровного стекла приготовьте гептановый клей, свернув двусторонний скотч и поместив его в бутыль объемом 100 mL.

Добавьте около 50 milliliters гептана, герметично закройте флакон и подвергайте его перемешиванию путем перекатывания в течение нескольких дней. Перед подготовкой эмбрионов создайте дегидратационную камеру, в которой эмбрионы будут находиться перед инъекцией. Для этого поместите чашку диаметром 35 millimeter внутрь чашки Петри диаметром 100 millimeter, чтобы создать «столик», и насыпьте вокруг него осушитель, представляющий собой безводный сульфат кальция, так чтобы высота осушителя была не выше уровня столика, затем накройте крышкой.

Для начала подготовки эмбрионов сначала соберите их из озерной клетки, меняя каждые два часа планшет с виноградным соком и дрожжами; визуализацию эмбрионов следует проводить примерно через два часа после начала сбора. Для подготовки покровного стекла поместите его на одну сторону предметного стекла микроскопа и закрепите четыре угла лентой, чтобы оно не смещалось. С помощью ватного тампона нанесите один слой гептанового клея полосой на покровное стекло.

Клей не должен быть вязким и должен высыхать за несколько секунд. Если он слишком густой, добавьте больше гептана. В завершение наклейте кусочек двустороннего скотча на предметное стекло рядом с покровным стеклом.

Смочите кисть. Осторожно перенесите эмбрионы с чашки с виноградным соком и поместите их на двусторонний скотч на предметном стекле. Затем, используя один конец пинцета, перекатывайте эмбрионы по двустороннему скотчу до тех пор, пока хорион не разорвется.

Подберите эмбрион, осторожно перекатывая его по поверхности Кориана, чтобы он прикрепился к пинцету, и поместите его на клей из гептана на покровном стекле. Расположите эмбрион так, чтобы его длинная сторона была параллельна длинной стороне покровного стекла. Поместите от 10 до 20 эмбрионов в один ряд.

Снимите покровное стекло и поместите его в камеру для дегидратации на три–восемь минут. Время выдержки зависит от влажности воздуха в помещении и объема вводимого вещества. Затем поместите покровное стекло в металлическую камеру с вакуумной смазкой.

Наконец, накройте эмбрионы галокарбоновым маслом, чтобы предотвратить их дальнейшее обезвоживание. Теперь эмбрионы готовы к инъекции. Сначала найдите эмбрионы, используя объектив 16 x.

Отодвиньте эмбрионы и найдите иглу, не меняя фокальной плоскости. Центрируйте иглу и переместите ее вверх, избегая смещения по осям X или Y. Чтобы открыть иглу, поместите край покровного стекла в поле зрения, но не в то место, где будет находиться игла.

Опустите иглу в ту же фокальную плоскость. Очень осторожно перемещайте покровное стекло до тех пор, пока оно не коснется иглы и аккуратно не вскроет образец. Поднимите иглу.

Теперь найдите эмбрионы в поле зрения. Опустите иглу в масло, убедившись, что из иглы выходят аккуратные жидкие капли. Плавно подведите эмбрион к игле, введите каплю в эмбрион, а затем отведите эмбрион в сторону.

После завершения инъекций всех эмбрионов их можно подвергнуть наблюдению на конфокальном микроскопе с объективом 60х или 100х. Контрольный эмбрион должен выглядеть как экземпляр в данном видео. Здесь представлен эмбрион, экспрессирующий GFP-тубулин и RFP-гистон, визуализированный с помощью объектива 100х на конфокальном микроскопе с вращающимся диском.

Общее время составляет восемь минут. Графики расстояния от полюса к полюсу обладают высокой воспроизводимостью и являются надежным показателем успеха в контрольных эмбрионах. Они должны выглядеть так же, как показано здесь для циклов с 11 по 13.

В данном видео показан еще один контрольный эмбрион. В этом образце экспрессируется KLP 61 FGFP, и в него был введен r Domine tubulin. Съемка также проводилась с использованием объектива 100x на конфокальном микроскопе с вращающимся диском; общая продолжительность записи составляет семь минут.

Данное видео было записано сразу после микроинъекции; в начале ролика отчетливо виден градиент концентрации r Domine тубулина. Эти эмбрионы можно использовать для изучения ингибирования Klp 61 F после микроинъекции антител к Klp 61 F. Мы наблюдаем исчезновение Klp 61 FGFP из веретен деления.

Мы только что продемонстрировали вам способ микроинъекций в эмбрионы дрозофилы на стадии дробления. При выполнении данной процедуры важно не забывать о проведении контрольных экспериментов: сначала потренируйтесь вводить только буфер или рутин, и убедитесь, что митоз протекает нормально вплоть до стадии целлюляризации. Как только ваши инъекции станут стабильными и перестанут наносить повреждения, вы сможете вводить ингибитор и изучать эффект конкретного ингибирования.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.