Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

Здравствуйте, меня зовут Хиллари Кемп, я из лаборатории Сесилии Оуэнс. А я — Сесилия Оуэнс. Мы с Хиллари работаем в отделе фундаментальной науки в Центре исследования рака имени Фреда Хатчинсона в Сиэтле.

Сегодня мы продемонстрируем вам методику создания химерных эмбрионов zebrafish, также известных как генетические мозаики. Эта процедура позволяет нам оценить клеточную основу функционирования генов в процессе развития. Мы можем определить, функционирует ли данный ген внутри клеток с мутантным фенотипом, что называется клеточно-автономной функцией, или в окружении этих клеток, что известно как клеточная неавтономность.

Мы создаем такие мозаики путем пересадки клеток между эмбрионами дикого типа или мутантными эмбрионами на стадии бластулы или ранней гаструляции. Впоследствии мы оцениваем функцию генов, наблюдая за фенотипом и генотипом клеток донора в среде реципиента. Итак, приступим.

В этой части протокола в эмбрион-донор вводится краситель для маркировки клеточных линий, чтобы можно было проследить судьбу клеток донора после трансплантации. С помощью данной методики также можно вводить любые виды нуклеиновых кислот; однако при инъекции ДНК следует пропустить этап модификации. Перед работой с эмбрионами подготовьте чашку для инъекций, поместив предметное стекло под углом 45 градусов в самую широкую часть чашки Петри. Заполните ее на три четверти средой для эмбрионов с содержанием 1,2% арос и добавлением пенициллина-стрептомицина.

Уберите предметное стекло после застывания агарозы, чтобы сформировать скошенную выемку. Заполните выемку средой для эмбрионов с добавлением пенициллина и стрептомицина. Теперь перейдите к ферментативной декортикации эмбрионов на одной стадии развития.

Инкубируйте эмбрионы на стадии одной клетки от одной до пяти минут в растворе Pronase с концентрацией 0.5 mg/mL. Внимательно следите за процессом дехорионизации.

Как только хорион начнет заметно сжиматься, погрузите эмбрионы в системную воду. Затем слейте всю жидкость вместе с хорионом, при этом эмбрионы должны остаться на дне в изгибе стакана. Очень важно, чтобы эмбрионы снова не коснулись поверхности воды. Теперь у большинства из них хорион удален, хотя несколько фрагментов все еще кружатся по краям.

Если какие-либо эмбрионы все еще находятся в хорионе, то такое пипетирование поможет извлечь их и высвободить, предотвращая их соприкосновение с поверхностью воды. Важно работать с покрытыми эмбрионами, используя пипетку, края которой были сглажены путем огневого полирования. Осторожно перенесите хрупкие эмбрионы, покрытые DEC, в желоб инъекционного блюдца с помощью стеклянной пипетки с широким отверстием, прошедшей огневое полирование.

Затем мы помещаем один файл в этот желоб. Теперь эмбрионы готовы к инъекции маркера линии с использованием точно откалиброванной стеклянной инъекционной пипетки, вытянутой с помощью микропожигателя, и установки для инъекций под давлением. Мы будем использовать чашку с эмбриональной средой для обрезки иглы и чашку с маслом для калибровки иглы.

Это обычное стандартное минеральное масло лабораторного качества. Мы берем пару заточенных часовых пинцетов и, глядя в окуляры для определения подходящего размера, помещаем пинцеты по обе стороны иглы, а затем осторожно отламываем кусочек, что я на самом деле не смогу сделать, не глядя. Чтобы определить объем вводимого красителя или рибонуклеотида перед началом работы.

Измерьте размер болюса в чашке с минеральным маслом. Иглу следует обломить таким образом, чтобы при одном или двух импульсах микроинъектора доставлялся болюс объемом 1 нл. Объем болюса можно рассчитать по его диаметру, измеренному с помощью окулярного микрометра.

Введите один нанолитр 1–3% раствора флуоресцентного декстрана непосредственно в желток покрытых эмбрионов на стадии от одного до четырех клеток. Я расположу эмбрион прямо под иглой, аккуратно введу иглу в центр желтка и нажму на педаль.

При проведении инъекции важно вводить краситель в желточные тяжи, чтобы он транспортировался в клетки. Такой инъекции будет достаточно для отслеживания клеток в химерных эмбрионах на протяжении нескольких дней развития. В идеале эту процедуру следует выполнить до того, как эмбрионы достигнут стадии четырех клеток. Выращивайте инъецированные эмбрионы при низкой плотности в покрытой чашке Петри, наполненной свежей средой для эмбрионов с добавлением пенициллина и стрептомицина.

Обратите внимание, что у инъецированных эмбрионов скорость развития обычно немного замедляется; инкубируйте эмбрионы при различных температурах — 25, 28 и 31 °C, чтобы разнести их развитие по времени и максимально расширить временное окно, в течение которого можно проводить трансплантацию. Аппарат для трансплантации клеток в бластулу данио-рерио состоит из шприца Hamilton с приводом, который соединен с помощью трехходового крана с резервуаром с минеральным маслом и с держателем микропипетки через отрезок гибкой трубки. Удалите все пузырьки воздуха из системы, так как они помешают точному контролю всасывания и давления.

Используйте стереомикроскоп с высококачественной оптикой и увеличением не менее DX. Для управления положением держателя микропипеты и иглы рекомендуется использовать ручной микроманипулятор NARA shige. Убедитесь, что он закреплен на столе с помощью магнитного основания, чтобы предотвратить передачу вибраций на трансплантат.

Иглы для трансплантации изготавливают из стеклянных капиллярных пипеток, которые вытягивают до получения плавного конуса с помощью электродного вытягивателя. Подробную процедуру вытягивания пипеток под диссекционным микроскопом и отламывания кончика вытянутой иглы см. в протоколе JoVE из лаборатории Мириам Гудмен. Для трансплантации на стадии бластулы внешний диаметр иглы должен составлять примерно 50–60 микрон, а для переноса на стадии гаструлы — 30–40 микрон.

Для улучшения проникновения при переносе на гастро-стадию необходимо сначала сформировать острый зазубрин на конце иглы с помощью микрокузнеца, предварительно сгладив кончик иглы, поднеся его вплотную к нити микрокузнеца. Затем поверните иглу так, чтобы передний край скоса мог соприкоснуться с нитью. Как только передний край иглы коснется нити, быстро отведите ее в сторону, чтобы создать зазубрину.

Чтобы избежать повреждения клеток, зазубрина должна быть прямой, а кончик иглы не должен быть изогнут. После подготовки установки и игл для трансплантации можно приступать к созданию химерных эмбрионов. Трансплантация на стадии бластулы используется для переноса клеток между эмбрионами, когда детальная информация о карте развития не требуется. За исключением первичных половых клеток, большинство клеток на данном этапе, как правило, еще не детерминированы.

Карта судьбы бластулы позволяет разграничить клетки, которые дадут начало эктодерме, и клетки, которые дадут начало мезодерме. Предшественники мезодермы и энтодермы расположены близко к краю эмбриона на стадии бластулы, в то время как предшественники эктодермы, из которых разовьются нервная система и поверхностный слой кожи, расположены дальше от края эмбриона. Таким образом, при трансплантации клеток в эмбрионы на стадии бластулы мы можем направлять эти клетки в область предполагаемой мезодермы или предполагаемой эктодермы.

Однако мы не можем направить клетки в какой-либо конкретный регион эктодермы или мезодермы, так как их положение неизвестно. На стадии бластулы, когда определена дорсальная сторона эмбриона, заранее подготовьте планшеты для инъекций, поместив пластиковый шаблон с парными рядами клиновидных выступов в чашку Петри, наполовину заполненную расплавленным 1,2% агарозом в среде для эмбрионов. После затвердевания агароза извлеките шаблон, чтобы в результате образовались ряды треугольных лунок, каждая из которых достаточно велика для размещения одного эмбриона.

Заполните форму для трансплантации средой для эмбрионов с пенициллином и стрептомицином, и с помощью огнеполированной стеклянной пипетки поместите по одному эмбриону на стадии бластулы в каждую лунку. Перенесите эмбрионы в лунки для трансплантации, изначально расположив их на боку. Расположите эмбрионы таким образом, чтобы эмбрионы-доноры находились в одном столбце, а эмбрионы-реципиенты — в соседнем.

Расположите чашку на предметном столике таким образом, чтобы при введении иглы для трансплантации в эмбрион игла прижимала эмбрион к задней стенке лунки. С помощью микроманипулятора опустите иглу для трансплантации в чашку под довольно крутым углом. В идеале игла для трансплантации должна входить в эмбрион под углом примерно 45 градусов.

Когда кончик иглы окажется ниже поверхности среды для эмбрионов, наберите небольшое количество среды в иглу, поворачивая микрометрический винт, управляющий шприцем Hamilton. Для обеспечения максимально точного контроля граница раздела между минеральным маслом и средой для эмбрионов должна находиться в тонкой конусообразной части иглы, но не слишком близко к концу. Осторожно зафиксируйте донорский эмбрион с помощью иглы, затем отведите иглу назад и введите ее в бластулярный слой эмбриона в нужном положении.

Быстрый и уверенный удар позволит игле проникнуть в зародыш, не вызвав его перекатывания. Медленно и осторожно наберите донорские клетки в иглу, чтобы избежать их повреждения из-за напряжения сдвига. Следите за тем, чтобы после забора необходимого количества клеток в иглу не попал желток.

Слегка измените давление в обратном направлении, чтобы прекратить всасывание, и извлеките иглу, приведя эмбрион-хозяин в нужное положение. Перемещая чашку для трансплантации, можно вносить небольшие коррективы в положение эмбриона-хозяина, осторожно поворачивая его с помощью трансплантационной иглы, стараясь не касаться желтка. При введении донорских клеток в эмбрион-хозяин избегайте засасывания желтка в эмбрион, так как это повредит и уничтожит донорские клетки; после завершения переноса клеток клетки из одного донорского эмбриона могут быть пересажены нескольким хозяевам.

Перенесите пары донор-реципиент в покрытые лунки 24-луночного планшета для дальнейшего развития. Единственным исключением из правила о том, что клетки на стадии бластулы еще не определены по своей дальнейшей судьбе, являются первичные половые клетки. Первичные половые клетки специфицируются на очень ранних этапах развития и предопределены к состоянию первичных половых клеток.

На очень ранней стадии первоначальные половые клетки располагаются у края бластулы и эмбриона на стадии гаструляции. Таким образом, если целью эксперимента по трансплантации является перенос первоначальных половых клеток, то крайне важно, откуда именно в донорском эмбрионе берутся эти клетки, и не имеет значения, куда они перемещаются в эмбрионе-реципиенте. Правило же для соматических клеток заключается в том, что их судьба определяется тем, куда именно в эмбрионе-реципиенте они перемещаются.

Что касается первичных половых клеток, крайне важно, из какой части эмбриона-донора они извлечены, так как их судьба уже предопределена. Если целью является трансплантация первичных половых клеток, то эти клетки необходимо забирать с края желточного пласта эмбриона-донора; на данной стадии развития (стадия сферы или высокая стадия) они расположены непосредственно у края эмбриона в виде четырех небольших кластеров, каждый из которых состоит из трех или четырех клеток. Забирать их нужно очень осторожно, чтобы случайно не начать всасывать желток.

Хорошо, я закончил с этим этапом, и теперь я перехожу к эмбриону-хозяину. Первичные половые клетки мигрируют в область генитального гребня любого эмбриона, в который они помещены. Таким образом, нет необходимости пересаживать эти первичные половые клетки к краю, они доберутся туда самостоятельно.

Таким образом, я просто пересаживаю их, возвращая в любое место постэмбриона. Ключевым моментом при трансплантации половых клеток, что совершенно противоположно любому другому виду трансплантации, является то, что имеет значение происхождение донорских клеток. Пересадка клеток в реципиент на стадии гаструляции позволяет экспериментатору воспользоваться картой развития zebrafish, которая проявляется при появлении эмбрионального щита.

Становится возможным различать разные типы тканей, а также области внутри предполагаемой центральной нервной системы. При переносе клеток между эмбрионами на стадии гаструляции в протоколе возможны некоторые вариации, однако общая процедура аналогична работе с бластомерами при подготовке гаструл. Сначала нанесите вертикальную полосу метилцеллюлозы в лунку стеклянного предметного стекла с углублением, затем залейте обильным количеством среды для эмбрионов с добавлением пенициллина и стрептомицина, используя огнеполированную переносную пипетку.

Поместите одного донора и трех хозяев на стадии щита на предметное стекло с углублением. Выберите эмбрионы донора, которые немного младше эмбрионов хозяев. Для манипуляций с гастрозаклеиванием потребуется новый инструмент: вставьте концы короткого отрезка рыболовной лески с разрывной нагрузкой 2 фунта в конец капиллярной трубки.

Таким образом формируется небольшая петля. С помощью петли аккуратно перекатите эмбрионы донора и реципиента на верхнюю часть полоски с метилцеллюлозой и погрузите их в метилцеллюлозу до надежной фиксации. Перекатите их так, чтобы целевая область оказалась сверху.

Поскольку при трансплантации игла вводится в эмбрион тангенциально для доставки донорских клеток без повреждения желточного мешка, трансплантации на стадии гаструлы лучше всего проводить с использованием составного микроскопа с фиксированным увеличением. Используйте органы управления микроманипулятора, чтобы сфокусировать кончик иглы для трансплантации.

Расположите держатель микропипетки и иглу под достаточно малым углом, чтобы игла была максимально близко к горизонтали, насколько позволяет край углубления на предметном стекле. Затем проколите эмбрион-донор. При правильном закреплении эмбрион не будет перекатываться при введении иглы для трансплантации, за исключением случаев, когда эмбрион слишком стар, что затрудняет проникновение иглы.

Чтобы избежать прокола желтка, иглу следует вводить в эмбрион на фокальной плоскости, которая находится чуть глубже, чем EDL. После прокола из донора можно извлечь большое количество клеток, достаточное для проведения до трех инъекций в клетки реципиента. При наборе клеток, при необходимости, перемещайте иглу, чтобы избежать засасывания желтка.

Для получения большего количества клеток с помощью той же иглы можно собрать дополнительные эмбрионы; при введении клеток в реципиентный эмбрион выталкивайте их, постепенно вытягивая иглу через целевую область, а не оставляйте клетки единым скоплением. Это повысит вероятность того, что донорские клетки внесут вклад в формирование нужной ткани. После завершения переноса клеток поместите весь предметное стекло в чашку Петри и осторожно залейте его средой для эмбрионов с добавлением пенициллина и стрептомицина.

В течение следующих нескольких часов метилцеллюлоза растворится, высвобождая эмбрионы. Количество переносимых клеток зависит от конкретной цели эксперимента. Клетки одного донора могут быть трансплантированы трем или четырем реципиентам на следующее утро после трансплантации.

Реципиентов можно исследовать, чтобы определить, была ли успешна доставка донорских клеток. Успешная трансплантация первичных половых клеток на стадии бластулы приводит к появлению флуоресцентно-маркированных клеток, расположенных вентрально, рядом с местом соединения желточного слоя (ylk) и его продолжения (ylk extension). Таким образом, мы продемонстрировали способ проведения трансплантации на стадиях гаструлы и бластулы.

При использовании данного метода важно выбрать подходящий тип трансплантации для ткани-мишени, в которую вы планируете направить свои клетки. Таким образом, трансплантация на стадии бластулы достаточна для определения того, перемещаются ли клетки в дерму или в эктодерму. Эту технику также можно использовать для воздействия на первичные половые клетки.

Для более точного картирования рекомендуется использовать трансплантат гастроулы, в котором уже определена дорсальная сторона. С помощью этой методики вы можете направлять клетки в различные отделы нервной системы, в частности, в передний, средний и задний мозг, а также в спинной мозг. На этом всё.

Большое спасибо за просмотр и успехов во всех ваших экспериментах.