Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

Здравствуйте, я Брюс Дрейпер из отдела молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Дейвисе, а я Сесилия Моанс из отдела фундаментальных наук Центра исследований рака Фреда Хатчинсона в Сиэтле. Сегодня мы с Сесилией продемонстрируем протокол криоконсервации спермы данио-рерио, который представляет собой модификацию оригинального протокола Брайана Харви. Мы покажем вам, что, работая в парах, можно криоконсервировать сперму 100 отдельных самцов менее чем за два часа.

Хотя после размораживания наблюдается широкий диапазон фертильности, в среднем мы получаем 25% фертильности, причем это данные из библиотеки, которая находилась в криоконсервации более семи лет. Итак, приступим. Перед выполнением данной процедуры сначала приготовьте растворы для замораживания спермы.

Раствор Рингера для рыб по Гинзбургу готовится заново каждые три дня, а среда для замораживания — ежедневно, с добавлением метанола и без него. Состав этих растворов можно найти в дополнительных онлайн-материалах к данному протоколу. Материалы, используемые в этой процедуре, могут влиять на скорость замораживания и размораживания, что, в свою очередь, может повлиять на фертильность замороженной спермы.

По этой причине список рекомендуемых материалов также представлен в дополнительных онлайн-материалах. Сперму лучше замораживать в мелкодисперсном сухом льду, а не в гранулах сухого льда. Один из простых способов измельчения сухого льда заключается в том, чтобы завернуть его в полотенце и разбить молотком.

Более эффективный метод заморозки спермы zebrafish заключается в использовании измельчителя с сухим льдом, такого как claws и модель RE two. Сначала отметьте лабораторным маркером капиллярные трубки объемом 10 µL на уровне 3,33 µL или примерно 16,7 мм от дна. Для анестезии самцов поместите два-четыре самца в стакан с разбавленным раствором trica в воде для рыб. Рецепт можно найти в книге по zebrafish.

После применения анестезии извлеките рыбу из анестетика с помощью пластиковой ложки и осторожно промокните ее бумажным полотенцем досуха. Уделите особое внимание просушиванию брюшной стороны. Вода активирует сперматозоиды, поэтому крайне важно тщательно просушить область вокруг пор.

Поместите рыбу на держатель с губкой брюшной стороной вверх. Если область вокруг брюшных плавников все еще влажная, осторожно просушите ее салфеткой Kimwipe. Вставьте маркированную капиллярную трубку в резиновый адаптер для ротового пипетора, который прилагается к капиллярным трубкам.

Адаптер представляет собой резиновую трубку с мундштуком на одном конце и держателем для капилляра на другом. В качестве альтернативы капиллярную трубку можно подключить к шприцу Hamilton объемом 50 µL. Используя короткий отрезок трубки Tigon соответствующего диаметра, поместите особь мужского пола под микроскоп и откройте доступ к урогенитальному отверстию, осторожно раздвинув тазовые плавники.

С помощью конца капиллярной трубки выжмите сперму, осторожно поглаживая бока рыбы гладким пинцетом или аккуратно сжимая бока рыбы указательным и большим пальцами; соберите сперму в капиллярную трубку по мере ее выделения, используя осторожное всасывание. Избегайте попадания фекалий, которые могут выделяться вместе со спермой. Целевой объем спермы составляет 3.3 microliters.

Минимально допустимое количество спермы варьируется в зависимости от её качества. Качественная сперма имеет белый непрозрачный цвет, в то время как низкокачественная сперма выглядит водянистой. В целом, минимально допустимым количеством является 1 µL качественной спермы (или одна треть от целевого объема) или 2 µL низкокачественной спермы (или две трети от целевого объема).

Если объем спермы не достигает целевого значения 3,3 microliters, необходимо довести объем до метки ручкой, используя среду для замораживания без метанола. Если объем спермы уже достигает или превышает метку на капиллярной трубке, перейдите к следующему шагу. Теперь добавьте криопротектор к сперме.

Наберите среду для замораживания с метанолом до оранжевой метки. Примерный общий объем теперь составляет 20 µL. Аккуратно вынесите смесь спермы и криопротектора на чистый участок часового стекла; осторожно перемешайте содержимое, четырежды pipetting (перенося жидкость вверх и вниз), избегая образования пузырьков.

Разделите сперму на две порции по криопробиркам, перенося по 10 µL раствора криопротектора для спермы на дно каждой маркированной пробирки. Быстро закройте пробирки крышками и поместите каждую криопробирку в отдельную фальконовскую пробирку объемом 15 мл. При комнатной температуре закройте фальконовские пробирки крышками и поместите их в мелкодисперсный сухой лед.

Пробирки следует вставить достаточно глубоко, чтобы были видны только крышки, для удобства контроля за пробирками типа «фалькон». Пронумеруйте их и зафиксируйте время помещения каждой пробирки в сухой лед. Оставьте сперму замораживаться в сухом льду на 20 минут.

После замораживания спермы перенесите две криопробирки в сосуд Дьюара с жидким азотом для временного хранения. Поместите контейнер для заморозки в ванну с жидким азотом, чтобы образцы не нагревались.

Используйте длинные металлические щипцы, чтобы извлечь пробирки из колбы Дьюара, и работайте с ними в криоперчатках. В качестве альтернативы криопробирки можно переносить из сухого льда непосредственно в морозильную камеру. Если контейнер для пробирок хранится в пенопластовом контейнере с погружением в жидкий азот для длительного хранения, поместите криопробирки в криогенный морозильник с жидким азотом.

Для поддержания жизнеспособности сперматозоидов крайне важно хранить пробирки погруженными в жидкий азот; пробирки, хранящиеся в паровой фазе, со временем могут терять жизнеспособность. Скорость действий также имеет решающее значение для сохранения жизнеспособности сперматозоидов. Интервал времени между добавлением криопротектора и помещением пробирок со спермой на сухой лед при проведении экстракорпорального оплодотворения должен составлять не более 30 секунд.

Работа с криоконсервированной спермой наиболее эффективно организована вдвоем. Один человек извлекает икру из самок, в то время как другой размораживает сперму. Установите температуру водяной бани на 33 °C.

Извлеките криопробирку из морозильника с жидким азотом и перенесите ее в контейнер или колбу с жидким азотом до момента размораживания. Выдавите икру из анестезированных самок в пластиковую чашку Петри диаметром 35 миллиметров. Этот процесс подробно описан в протоколе JoVE под названием Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, в котором приводится детальное описание данной процедуры для zebrafish.

При экстракорпоральном оплодотворении хорошая порция должна содержать более 150 однородных и желтоватых икринок. Наличие любых белых включений свидетельствует о деградации. По возможности постарайтесь получить три порции икры и объединить их в одной чашке.

Если в течение одной минуты после первого захвата не удалось получить три качественных захвата, переходите к следующему шагу. Держите чашку закрытой, пока происходит размораживание спермы. Тем временем извлеките пробирку из жидкого азота и снимите колпачок.

Быстро погрузите флакон наполовину в водяную баню при 33 °C на 8–10 секунд. Быстро добавьте во флакон 70 µL сбалансированного солевого раствора Хэнкса комнатной температуры и перемешайте, несколько раз пропустив жидкость через наконечник пипетки; немедленно перенесите содержимое к икринкам в чашку Петри и осторожно перемешайте кончиком пипетки. Затем сразу активируйте сперматозоиды и икринки, добавив 750 µL аквариумной воды; перемешайте круговыми движениями и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут поместите рыбу в чашку с водой и инкубируйте при 28 °C. Через два-три часа подсчитайте количество жизнеспособных эмбрионов и перенесите их в чашки диаметром 100 мм из расчета 50 эмбрионов на одну чашку. Также подсчитайте количество оплодотворенных икринок, чтобы определить фертильность образца спермы.

Фертильность сперматозоидов представляет собой отношение количества жизнеспособных эмбрионов к общему числу яйцеклеток, использованных для In vitro fertilzation. Сортировку яйцеклеток можно проводить в интервале от двух до шести часов после оплодотворения in vitro. Неоплодотворенные яйцеклетки легко отличить от жизнеспособных эмбрионов по их прозрачности и отсутствию деления.

При просмотре с трансмиссионным освещением на стереомикроскопе средняя фертильность криоконсервированных сперматозоидов значительно варьирует. Тем не менее, представляется возможным достичь среднего показателя фертильности 25%, который остается стабильным на протяжении нескольких лет. На данном графике показан средний процент фертильности сперматозоидов, замороженных в период с 2001 по 2003 год и размороженных вплоть до 2008 года.

Мы только что продемонстрировали высокопроизводительный метод криоконсервации спермы рыб зеброфиш. При выполнении данного протокола важно использовать все рекомендованные пластиковые изделия и оборудование, а также использовать измельченный сухой лед вместо гранул сухого льда. Критически важно использовать высококачественную сперму и икру; при проведении In Vitro оплодотворения после размораживания спермы следует использовать как можно большее количество икринок, чтобы увеличить число жизнеспособных эмбрионов на выходе, что может потребовать использования трех или четырех самок.

Еще одним ключевым компонентом протокола является скорость. С момента получения спермы от самца до ее помещения в сухой лед должно пройти не более одной минуты. Думаю, на этом всё.

Желаем удачи в ваших экспериментах.