Визуализация бьющееся сердце в Drosophila

Здесь будут представлены две методики визуализации бьющегося сердца Drosophila для препарирования сердца взрослой особи. Сначала голову и грудь удаляют одним разрезом вдоль указанной линии. Затем удаляют гениталии и с помощью пинцета вскрывают брюшную полость, после чего извлекают кишечник и, в случае самки, яичники.

Жировое тело в области третьего и четвертого брюшных сегментов осторожно отсасывают, чтобы обнажить сердце взрослой особи для иммобилизации личиночного сердца. Одиночную личинку, помещенную в буферный раствор, фиксируют, нанося гистологический акриловый клей сначала вокруг области головы личинки. Личинку аккуратно растягивают, затем наносят клей на задний конец и на боковые стороны стенки тела личинки.

Здравствуйте, я Джи. Ай. Флер. Здравствуйте, я Карен Эр. Мы оба являемся участниками программы «Развитие и старение» в Институте медицинских исследований Бернема.

Сегодня мы продемонстрируем разработанные нами процедуры для визуализации бьющегося сердца личинок и взрослых особей Drosophila. Мы используем оба этих метода для визуализации, изучения и количественного анализа параметров сердцебиения плодовой мушки Drosophila. Прежде чем приступить к работе, необходимо приготовить раствор искусственного гемолимфы.

Этот раствор содержит сахарозу, которую следует добавить в искусственный гемолимфатический раствор из охлажденных стоковых растворов непосредственно перед использованием. Чтобы предотвратить бактериальное загрязнение, доведите искусственный гемолимфатический раствор до комнатной температуры и оксигенируйте его путем барботирования воздухом в течение не менее 15 минут. Затем с помощью стандартного пуллера для пипеток вытяните несколько тонких капилляров, которые понадобятся для удаления жировых тел у мухи.

После того как вся подготовка завершена, взрослых мух необходимо подвергнуть анестезии. Это можно сделать путем кратковременного воздействия препарата fly nap в течение двух-пяти минут, однако следует следить за тем, чтобы мухи не находились под воздействием fly nap более пяти минут. Для анестезии мух также можно использовать кратковременное охлаждение, но использование диоксида углерода не рекомендуется, так как он оказывает более длительное воздействие на частоту сердечных сокращений и подвижность.

Затем анестезированных мух помещают спинной стороной вниз в чашку Петри, покрытую тонким слоем вазелина. Гидрофобная кутикула крыльев и тела должна обратимо прилипать к вазелину, при этом при необходимости положение мухи можно изменить. Первый разрез делают с помощью изогнутых пружинных ножниц.

Это выполняется путем размещения лезвий ножниц под ногами мухи под углом вниз к дорсальной поверхности в области шеи. Головной вентральный нервный шнур и ноги удаляются одним разрезом. Затем с помощью пружинных ножниц препарат погружают в оксигенированный раствор искусственного гемолимфатического раствора.

Задний кончик брюшка, состоящий из седьмого и восьмого сегментов, удаляют одним разрезом. Это обеспечивает доступ для выполнения латеральных разрезов вдоль обоих краев брюшка и служит для разрыва связи между задним отделом кишечника и кутикулой брюшка. Введите лезвия ножниц в небольшое отверстие на кончике брюшка и разрежьте кутикулу латерально.

Это освобождает один край вентральной кутикулы. Захватите лоскут пинцетом и сделайте аналогичный разрез вдоль противоположного латерального края брюшка. После этого освобожденный лоскут вентральной кутикулы брюшка можно удалить.

Кишечник и другие органы брюшной полости обычно можно удалить единой массой с помощью ювелирного пинцета и осторожного вытягивания. Удаление внутренних органов открывает бьющийся сердечный сосуд, который все еще прикреплен к дорсальной кутикуле небольшими мышечными волокнами и окружен жировыми телами. Вытянутые капилляры вводятся в пластиковую трубку диаметром 1/16 дюйма, подключенную к источнику вакуума.

Сила всасывания пропорциональна диаметру наконечника, поэтому после настройки не следует использовать пипетки с наконечниками диаметром более 40 микрон. Эта система всасывания используется для удаления излишков жира вокруг сердечной трубки. Она также может применяться для удаления пузырьков воздуха, скапливающихся вокруг кутикулы, и любого мусора.

Необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не коснуться самого сердца, а поскольку задняя часть сердца очень хрупкая, следует избегать манипуляций и в этой области. Теперь трубка сердца взрослой дрозофилы открыта и при необходимости должна сокращаться. Кутикулу с прикрепленным к ней сердцем можно переместить, осторожно приподняв кутикулу из вазелина и аккуратно прижав её обратно.

Избегайте любого контакта с тканью сердца. На данном этапе раствор, в котором находится препарат, следует заменить свежей искусственной гемолимфой. Перед проведением любых манипуляций препарату необходимо дать стабилизироваться в течение 20–30 минут при условии оксигенации.

Если препарат необходимо поддерживать более 60 минут, следует провести повторную перфузию свежей искусственной гемолимфой. Теперь данный препарат готов к использованию для оптической регистрации; также он может быть использован для электрофизиологической регистрации или гистологических манипуляций. Для визуализации сердцебиения непосредственно внутри личинок требуется применение другой методики.

Сначала подготовьте покровные стекла за день до проведения процедуры. Для этого с помощью зубочистки нанесите около 50–70 µL раствора Sylgard на покровное стекло размером 22 × 22 мм. Оставьте Sylgard затвердевать при 65 °C на ночь.

Далее приготовьте буфер Броди и Бейтса; после приготовления аликвоты можно хранить при температуре -20 °C и размораживать по мере необходимости. В завершение подготовьте инструменты, необходимые для нанесения гистоакрилового клея. Сначала вытяните несколько тонких капилляров.

Затем соедините наконечник дозатора объемом 1.5 мл с небольшим пластиковым трубочкой диаметром примерно 1/32 дюйма. Вставьте капилляр узким концом в трубку, чтобы широкое отверстие было направлено в другую сторону. После завершения сборки заполните капилляр гистологическим клеем, погрузив его в каплю клея и осторожно втянув содержимое в пластиковый наконечник.

При работе с клеем следует держать под рукой второй стеклянный капилляр, чтобы удалять излишки клея с кончика капилляра с клеем. Клей остается жидким до момента контакта с фосфатно-солевым буферным раствором, в котором он затвердевает в течение нескольких секунд. Тем не менее, он обычно остается пластичным достаточно долго, чтобы его можно было удалить с кончика капилляра или распределить по образцу при нанесении.

Теперь, чтобы приступить к иммобилизации личинок, нанесите каплю гистологического акрилового клея рядом с каждым углом покровного стекла Sylgard. Добавьте 50 µL буфера B&B на капли клея, который мгновенно затвердеет, затем заполните пространство между склеенными участками буфером B&B. Клей удержит буфер на предметном стекле.

Возьмите личинку стадии L3 в фазе активного перемещения и поместите её на кусочек влажной салфетки на льду на две минуты. Это замедлит её движение. Затем перенесите личинку в буфер и расположите её дорсальной стороной вверх.

Это сторона личинки, на которой отсутствуют идентичные пояски. Быстро нанесите небольшое количество клея между областью головы и ограничительным бортиком. Клей затвердеет очень быстро, что предотвратит смещение головы личинки.

С помощью пинцета осторожно захватите животное за задние выступы и аккуратно растяните его. Зафиксируйте личинку в этом положении, нанося клей вдоль обеих сторон личинки в ее задней половине. Чтобы ограничить дальнейшее движение кутикулы под воздействием мышц тела, нанесите дополнительный клей на бока животного.

Теперь личинка зафиксирована в этом положении. Предметное стекло можно поместить в небольшую чашку Петри, наполненную искусственной гемолимфой или PBS; теперь можно регистрировать сердцебиение без помех со стороны движений стенок тела. Полуинтактное сердце взрослой drosophila будет ритмично биться в течение нескольких часов после диссекции при условии поддержания в свежей оксигенированной искусственной гемолимфе.

Репрезентативный пример показан здесь и в дополнительном видео №1; сердца личинок третьей стадии, представленные здесь, и молодых мух в возрасте от одной до трех недель после вылупления обычно демонстрируют регулярное сердцебиение с частотой от 1 до 3 Hz. У мух старше трех недель сердцебиение обычно более аритмично. Тем не менее, такие сердца все еще способны спонтанно сокращаться в течение нескольких часов в оксигенированной искусственной гемолимфе. Сердца взрослых мух, поврежденные в результате процедуры диссекции, обычно имеют локализованные области экстремального сужения, которые не способны расслабиться и часто сокращаются неконтролируемо. Частота сердцебиения ниже 1 Hz редко наблюдается у мух младше трех недель.

Следовательно, такие препараты считаются поврежденными и утилизируются. Мы только что продемонстрировали, как подготовить сердца личинок и взрослых плодовых мушек для оптической визуализации. Помните, что при создании полуинтактного препарата нельзя касаться самого сердца.

На этом все. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.