Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге
5 ноября 2009 г.
Аналитической ультрацентрифуге (AUC) образца ячейка содержит образцов и эталонов буфера и в ходе экспериментов и подвергается воздействию высокого вакуума и ротора со скоростью до 60000 оборотов в минуту. Это видео будет демонстрировать строгим вниманием к деталям необходимые для сборки, погрузки и выравнивание этого очень важная составляющая эксперимента AUC.
Здравствуйте, я Андреа Бальбо. Я работаю в группе Питера Шакса в Национальных институтах здоровья. В этом видео мы продемонстрируем вам процедуры сборки, загрузки и юстировки ротора кюветы аналитического ультрацентрифугирования.
Приступим. Перед нами компоненты кюветы для аналитического ультрацентрифугирования. Внутри корпуса кюветы расположен двухсекторный угольный заполнитель из эпоксидной смолы диаметром 12 миллиметров, который будет зажат между двумя оконными узлами. Каждый оконный узел состоит из оконной прокладки, оконной вставки и окна, закрепленного в оконном держателе.
Затем эти детали задвигаются внутрь корпуса кюветы, совмещая их шпоночные пазы с направляющим ключом внутри ствола корпуса; после установки прокладки корпуса зажимное кольцо закрывает измерительную ячейку с приложением крутящего момента от 120 до 140 inch pounds. После загрузки образца в две заглушки корпуса с прокладками, которые герметизируют загрузочные отверстия кюветы для предотвращения появления артефактов сканирования, утечек и повреждений во время экспериментов, крайне важно, чтобы все компоненты были чистыми, сухими, без пыли и находились в наилучшем состоянии; регулярно проверяйте их и заменяйте при необходимости. Вам также понадобятся следующие принадлежности: аналитическая ультрацентрифуга, четырехточечный титановый ротор, лабораторные весы, динамометрический ключ с читаемым циферблатом и динамометрическая стойка, противовес и грузы для противовеса, плоская отвертка, пинцет, дозатор на 200 µL с длинным конусным наконечником, инструменты для центрирования и смазка для центрифугирования.
Мы начинаем сборку кюветы с образцом с объединения двух узлов окна. Сначала поместите прокладку окна на дно держателя окна. Затем установите вкладыш окна (иногда называемый демпфером окна) внутрь держателя окна так, чтобы отверстие вкладыша находилось напротив шпоночного паза держателя под небольшим углом.
Затем поместите окно в держатель, совместив метку на окне с пазом держателя окна. Осторожно нажмите на самые края окна с обеих сторон. Чтобы обеспечить надлежащую герметизацию и точную подгонку кюветы с образцом, мы слегка смазываем уплотнение корпуса в винтовом кольце.
С помощью смазки для центрифугирования нанесите очень небольшое количество состава, распределив его между большим и указательным пальцами. Покройте резьбу стопорного кольца тонким, невидимым слоем смазки. Аналогичным образом смажьте уплотнительную прокладку корпуса.
Удалите остатки видимой смазки. Для начала сборки кюветы вставьте один узел окна окном вверх в корпус кюветы, совместив шпоночный паз с шпонкой корпуса.
Совместите шпоночный паз центральной части с шпоном корпуса и аккуратно опустите её на узел окна внутри корпуса. Категорически запрещается использовать любые инструменты для заталкивания центральной части в корпус кюветы. Это может привести к необратимому повреждению центральной части, что вызовет утечки в ходе экспериментов.
Поверните вторую оконную сборку так, чтобы окно было обращено к центральной части и от вас. Совместите шпоночный паз с шпонкой корпуса и сдвиньте сборку вниз поверх центральной части. Сверху установите прокладку корпуса.
Затем установите стопорное кольцо так, чтобы надпись «out» была видна. Сделайте это пальцами. После этого, используя инструмент для центровки, затяните стопорное кольцо вручную.
Иногда центральный элемент не входит легко в ствол корпуса. В таком случае сначала выровняйте его, а затем поместите сверху вторую оконную сборку. Окажите легкое давление на оконную сборку, направленное вниз.
Их можно одновременно вставить в корпус кюветы. Таким образом мы избегаем прямого давления на центральную часть. Сейчас подходящий момент, чтобы проверить кювету на наличие пыли, ворса и отпечатков пальцев.
Вы также заметите кольца Ньютона, которые указывают на наличие воздуха между центральной частью и окнами. Они исчезнут после затягивания винтового кольца до тех пор, пока слово «out» не станет видимым. Полностью опустите кювету с образцом внутрь ячейки.
Зажмите ячейку в цанговом зажиме динамометрического стенда. Удерживайте ячейку неподвижно, оказывая постоянное давление на рукоятку стенда. Одним плавным движением затяните стопорное кольцо с моментом от 120 до 140 inch pounds.
Отпустите рукоятку штатива для создания крутящего момента и осторожно извлеките кювету с образцом. Обычно мы загружаем объем 400 µL в каждый сектор центрального элемента диаметром 12 mm. С помощью дозатора на 200 µL установите кювету с образцом так, чтобы отверстия для загрузки находились сверху, а слово «out» на зажимном кольце было видно.
Сдвиньте наконечник пипетки наполовину вниз в левый сектор центральной части через загрузочные отверстия и медленно внесите 200 µL эталонного раствора. Повторите процедуру еще раз, чтобы общий объем составил 400 µL, используя тот же наконечник пипетки и соблюдая ту же технику осторожно и медленно. Заполните правый сектор центральной части 400 µL раствора образца.
Крайне важно максимально точно совместить объемы эталонного и исследуемого растворов. Плотная установка наконечника на пипетку, медленное всасывание и вытеснение растворов, предотвращение попадания пузырьков воздуха, а также использование одного и того же наконечника для обоих растворов — всё это способствует соблюдению равенства объемов для герметизации кюветы.
Плотно вставьте две красные прокладки заглушек корпуса в каждое загрузочное отверстие, убедившись, что они аккуратно расположены между центральной частью и алюминиевым корпусом. Закройте каждое загрузочное отверстие заглушкой корпуса и затяните вручную с помощью небольшой плоской отвертки. Перед установкой ротора убедитесь, что вес противовеса и кюветы, расположенной напротив противовеса, различается не более чем на 0.5 grams.
Установите нулевое значение баланса. Сначала взвесьте кювету с образцом, которая будет находиться в позиции напротив противовеса. Обнулите баланс, чтобы вычесть вес кюветы с образцом.
Затем взвесьте противовес. В данном случае противовес оказался на 4,193 грамма легче кюветы с образцом. Выберите груз-противовес массой 4 грамма и вкрутите его в отверстие для крепления противовеса, убедившись, что он не выступает над верхней поверхностью.
Снова взвесьте противовес, чтобы убедиться, что итоговая масса отличается не более чем на 0,5 grams. Используя четырехместный ротор, установите противовес в четвертую позицию так, чтобы белая стрелка была видна и указывала в направлении центробежной силы. С помощью инструмента для выравнивания убедитесь, что противовес полностью опущен внутрь ротора.
Установите балансировочную кювету так, чтобы заглушки корпуса были обращены к центру ротора, а слово «out» на стопорном кольце было видно. Снова с помощью инструмента для выравнивания убедитесь, что кювета полностью погружена в ротор. Вид снизу ротора.
Выровняйте внутреннюю часть. С помощью инструмента для выравнивания нанесите риску, совместив метку, ближайшую к центру ротора, с риской на противовесе. Аналогичным образом выровняйте кювету с образцом в позиции два.
После выравнивания всех кювет ротор готов к установке в камеру центрифуги.
Обзор
В данном видео демонстрируются сборка, загрузка и центрирование кюветы аналитического ультрацентрифуга (AUC), что имеет решающее значение для проведения экспериментов методом AUC. Особое внимание уделяется правильному обращению с компонентами кюветы и их подготовке для обеспечения точности результатов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Аналитическое ультрацентрифугирование
- Биофизические методы
- Методы подготовки проб
Теоретическая часть
- Кювета для аналитического ультрацентрифугирования (AUC) необходима для проведения экспериментов при высоких скоростях вращения ротора.
- Она состоит из нескольких компонентов, которые должны быть точно собраны.
- Соблюдение чистоты и правильная центровка имеют решающее значение для предотвращения появления экспериментальных артефактов.
- Понимание процесса сборки жизненно важно для исследователей, использующих AUC.
Цель исследования
- Предоставить подробное руководство по сборке и загрузке ячейки для анализа в AUC.
- Подчеркнуть важность тщательной подготовки в экспериментах с использованием AUC.
- Обеспечить возможность точного воспроизведения процесса исследователями.
Используемые методы
- Сборка оконных блоков и центрального элемента в кювете.
- Приложение крутящего момента для фиксации компонентов кюветы.
- Загрузка эталонного и исследуемого растворов в кювету.
- Балансировка кюветы с помощью противовеса для обеспечения точности измерений.
Основные результаты
- Успешная сборка ячейки для AUC, продемонстрированная в видео.
- Правильные методы загрузки обеспечивают минимальное количество пузырьков и равные объемы.
- Регулировка противовеса имеет решающее значение для точной работы ротора.
- Визуальные индикаторы, такие как кольца Ньютона, помогают оценить качество сборки.
Выводы
- Внимание к деталям при сборке кюветы образца имеет решающее значение для экспериментов AUC.
- Следование изложенным процедурам позволяет повысить надежность эксперимента.
- Рекомендуется проводить регулярное техническое обслуживание и осмотр компонентов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Правильная сборка и центровка кювет для аналитического ультрацентрифугирования имеют решающее значение для получения надежных биофизических данных о размере, форме, чистоте и состояниях олигомеризации белков. Тщательная подготовка кювет минимизирует экспериментальные артефакты, обеспечивая целостность данных для валидации мишеней и изучения механизмов на ранних этапах разработки лекарственных средств. Такая процедурная строгость повышает прогностическую достоверность в последующих рабочих процессах скрининга и оптимизации соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает точное определение состояний олигомеризации белков и белок-белковых взаимодействий, что напрямую служит основой для гипотез по валидации мишеней.
- Операционная ценность: позволяет проводить безметочный анализ свойств макромолекул в растворе в условиях, близких к нативным.
- Прогностическая ценность: снижает механистическую неопределенность при оценке рисков мишени за счет получения количественных коэффициентов седиментации и параметров формы.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Предоставляет данные о гидродинамическом размере и форме, которые необходимы для разработки состава буфера для анализа и скрининга стабильности.
- Операционная ценность: Обеспечивает целостность и монодисперсность образца, что критически важно для воспроизводимости биохимических и клеточных анализов.
- Интеграция с платформой: Обеспечивает биофизическую характеристику очищенных мишеней перед проведением кампаний по высокопроизводительному скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет оценивать формирование белковых комплексов и конформационные изменения, имеющие значение для механизмов развития заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает контроль воспроизводимости между партиями рекомбинантных белков, используемых в доклинических моделях.
- Трансляционная преемственность: связывает биофизическую характеристику мишеней с функциональными тестами в системах, релевантных для изучаемых заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Рабочий процесс с использованием кюветы аналитического ультрацентрифуга интегрируется в континуум поиска — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая биофизические показатели, которые служат основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки на основе поведения и стабильности мишени.
- Биологические исследования: Обеспечивает проверку гипотез об олигомеризации мишени и сетях взаимодействий, что позволяет снизить биологические риски до начала разработки анализа.
- Скрининг: Гарантирует монодисперсность и стабильность мишени, что напрямую влияет на готовность анализа и качество данных в кампаниях по скринингу.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения коэффициента седиментации и молекулярной массы для сравнения состояний белков при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает биофизические свойства очищенной мишени с функциональной валидацией в доклинических моделях за счет обеспечения стабильного качества материала.
- Корпоративное использование: Представляет собой стандартизированный, многократно используемый инструмент биофизической характеристики для различных мишеней и проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в свойствах мишени, снижение механистической неопределенности и повышение строгости валидации мишени.
- Операционная ценность: Стандартизированная подготовка образцов, воспроизводимость между сериями экспериментов и масштабируемость между лабораториями.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), снижение частоты неудач из-за нестабильности мишени и повышение эффективности использования капитала на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с учетом рисков на основе данных биофизического снижения рисков.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области биофизических методов и опыт прецизионной работы с оптическими компонентами.
- Необходимость в использовании аналитического ультрацентрифуга, динамометрических ключей, инструментов для юстировки и соблюдении правил работы с образцами в условиях чистого помещения.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов очистки, сборки и приложения крутящего момента.
- Предполагает учет особенностей адаптации для различных типов образцов, условий буфера и геометрии центральных элементов.
- Ограничено хрупкостью компонентов; окна и центральные элементы подвержены повреждениям из-за частиц загрязнения, неправильного крутящего момента или нарушения центровки.
